分离的克里斯滕森菌、包含其的组合物及用途的制作方法

本技术涉及微生物领域，更具体涉及分离获得的克里斯滕森菌新菌种、包含其的组合物及用途。

背景技术：

1、克里斯滕森菌属(christensenella)是近年来鉴定出的肠道共生细菌，该菌属下的菌种数极其有限，根据在lpsn上的查询仅有6个菌种，且都是近年来发现的。

2、克里斯滕森菌属新菌种的筛选面临很大困难，原因是其主要存在于人或动物肠道中，属于严格厌氧的微生物，对营养及培养环境要求极高，并且生长周期长。另外，在进行药效验证的时候，该菌属的菌因为厌氧而难以通过体外细胞实验进行验证；在动物体内实验过程中，该菌属的菌由于培养困难、厌氧程度高而很难保持稳定的活菌数，且存在重复性不足的问题。这些体内外相关的技术难题均限制了克里斯滕森菌属新菌种的发现及应用。

3、当前肥胖、糖尿病、高血压、高脂血症、脂肪肝等代谢性疾病的患病率不断增加，同时也有研究表明这些疾病与微生物菌群的生态失调有关。在许多人群中，克里斯滕森菌属的某些菌与低体重指数相关。小克里斯滕森氏菌(c.mintua)是克里斯滕森菌属中研究最多的一个菌种，然而同时有报道表明其在治疗肥胖的过程中会导致炎症，如急性阑尾炎。然而，在肥胖治疗的过程中不引发炎症，是一个迫切需求，也是临床减肥药物行政审批的一个重要考量点。

4、现有技术中通常使用多种微生物混合物用于治疗代谢和肥胖相关疾病或障碍，例如益生菌或者肠道菌群移植(fmt)。然而，多种微生物的混合物使得机理更复杂，各微生物之间的相互影响也未有成熟的研究，且微生物混合物的使用会打破肠道菌群的稳态。相比较而言，单菌对肠道菌群的稳态影响较小。此外，微生物混合物的使用，还需要额外考虑各微生物是否会影响彼此的活性，同时也无法明确是微生物混合物的协同作用使其在疾病的治疗或预防中起作用，还是某一种单菌在疾病的治疗或预防中起作用。

5、微生物资源的数量极其庞大，而从中筛选出能够有效用于治疗或预防例如肥胖、糖尿病、高血压、高脂血症、肝肾功能疾病等代谢性疾病的新菌种是一项巨大挑战，但同时也代表着巨大的未满足的需求。

技术实现思路

1、本技术通过基因预测菌株的丁酸通路完整性，来预测其产短链脂肪酸的能力，筛选获得了能够有效治疗或预防代谢性疾病的克里斯滕森菌株。

2、第一方面，本技术提供了分离的克里斯滕森菌(christensenella sp.)，其与保藏编号为gdmcc no：62509的菌株或保藏编号为gdmcc no：61118的菌株的平均核苷酸同一性(ani)值为至少95％，和/或具有与seq id no.1或2所示的序列具有至少98.65％、至少98.7％、至少98.8％、至少98.9％、至少99.0％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％同一性的16s rdna序列。

3、在一些实施方案中，所述克里斯滕森菌是克里斯滕森菌属(christensenella)的一个新菌种，所述新菌种中的菌株与保藏编号为gdmcc no：62509的菌株或保藏编号为gdmcc no：61118的菌株的平均核苷酸同一性(ani)值为至少95％，例如95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％、95.6％、95.7％、95.8％、95.9％、96％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％；和/或通过16s rdna比对，该菌种中的菌株的16s rdna序列与seqid no.1或2所示的序列具有至少98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.65％、至少98.7％、至少98.8％、至少98.9％、至少99.0％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％同一性。

4、在一些实施方案中，所述克里斯滕森菌的代谢产物包括短链脂肪酸，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、丁戊酸、戊酸和己酸中的至少一种；优选地，所述克里斯滕森菌能高产丁酸和乙酸；其中，丁酸产量不低于50μg/g和/或乙酸的产量不低于300μg/g；更优选地，所述丁酸产量不低于400μg/g和/或所述乙酸产量不低于2600μg/g。

5、在一些实施方案中，所述克里斯滕森菌为保藏编号为gdmcc no：62509或gdmccno：61118的克里斯滕森菌。

6、第二方面，本技术提供了包含第一方面所述的克里斯滕森菌或其培养物或其代谢产物的组合物。

7、在一些实施方案中，所述克里斯滕森菌的培养物包括克里斯滕森菌的固体培养物，发酵培养物、或者发酵培养物的上清。

8、在一些实施方式中，所述发酵培养物或发酵培养物上清为使用液体培养基在厌氧培养条件下得到的发酵培养物或发酵培养物上清液。

9、在一些实施方案中，其中所述组合物以液态形式或固态形式提供。

10、在一些实施方案中，所述组合物包含1×104至1×1013cfu/ml或1×104至1×1013cfu/g的所述克里斯滕森菌活菌。

11、在一些实施方案中，所述组合物包含1×104至1×1012cfu/ml或1×104至1×1012cfu/g的所述克里斯滕森菌活菌。

12、在一些实施方案中，所述组合物包含1×105至1×1011cfu/ml或1×105至1×1011cfu/g的所述克里斯滕森菌活菌。

13、在一些实施方案中，所述组合物包含1×106至1×1010cfu/ml或1×106至1×1010cfu/g的所述克里斯滕森菌活菌。

14、在一些实施方案中，所述组合物包含1×107至1×109cfu/ml或1×107至1×109cfu/g的所述克里斯滕森菌活菌。

15、在一些实施方案中，每g所述组合物中包含1×103至1×1014个菌落形成单位(cfu)的菌；例如1×104至1×1012个、1×105至1×1011个或者1×106至1×1010个菌落形成单位(cfu)的菌，具体地，例如1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013、9×1013个或其间任意值的菌落形成单位(cfu)的菌。

16、在一些实施方案中，所述组合物中的克里斯滕森菌为减毒菌、被杀死的菌、冻干菌或经辐照的菌。

17、在一些实施方案中，所述组合物为液体、泡沫、乳膏、喷雾剂、粉末(例如冻干粉末)或凝胶的形式。

18、在一些实施方案中，所述组合物为粉剂、微囊化粉剂、胶囊、片剂、锭剂、颗粒剂、口服液、混悬液、乳剂、液体制剂、缓释制剂、纳米制剂或微封装胶囊的形式。

19、在一些实施方案中，所述组合物为口服剂或注射剂的形式。

20、在一些实施方案中，所述的组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂或辅料。

21、所述药学上可接受的辅料是本领域技术人员熟知的。

22、在一些实施方案中，所述辅料可以为选自载体、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂以及香料中的至少一种。

23、在一些实施方案中，所述组合物包含缓冲剂(例如碳酸氢钠、婴儿配方奶或无菌人乳或其它允许细菌存活和生长的试剂(例如，在胃的酸性环境中存活和在肠环境中生长))、冻干保护剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压实剂、润滑剂、分散增强剂、崩解剂、抗氧化剂、调味剂、甜味剂和着色剂中的一种或多种。

24、在一些实施方案中，所述组合物还包含用于预防或治疗代谢性疾病的一种或者多种其它活性剂。

25、所述其它活性剂具有以下至少一种功能：(a)抑制食欲，(b)预防代谢性疾病，(c)治疗代谢性疾病。

26、在一些实施方案中，所述抑制食欲包括降低摄食量和/或降低食欲。

27、在一些实施方案中，所述其它活性剂选自：glp-1受体激动剂，glp-1受体和gcg受体双重激动剂，glp-1受体、gip受体和gcg受体三重激动剂，ampk激动剂或促进glp-1分泌的活性药物。

28、在一些实施方案中，所述其它活性剂选自：二甲双胍、磺脲类、氯茴苯酸、噻唑烷二酮类、dpp-4抑制剂、glp-1受体激动剂、sglt2抑制剂、胰岛素、吡格列酮、罗格列酮、己酮可可碱、ω-3-脂肪酸、他汀类药物、依折麦布、或熊去氧胆酸、司美格鲁肽、利拉鲁肽、艾塞那肽、贝那鲁肽。

29、在一些实施方案中，所述其它活性剂为二甲双胍。

30、在一些实施方式中，所述组合物可以配制成冷冻组合物，例如经速冻和干燥，或冻干制成的冷冻组合物，以用于储存和/或运输。

31、在一些实施方式中，所述组合物是经喷雾干燥获得的。在一些实施方案中，所述组合物是经静电喷雾干燥获得的。

32、在一些实施方案中，所述组合物中的所述菌株是冷冻干燥或喷雾干燥的。在一些实施方式中，所述组合物中的所述菌株是静电喷雾干燥的。在一些实施方式中，所述组合物中的所述菌株被冷冻干燥或喷雾干燥并且是活的。在一些实施方式中，所述组合物中的所述菌株被冷冻干燥或喷雾干燥并且能够部分或完全定植于肠。在一些实施方式中，所述菌株在给药前进行重构。在一些情况下，所述重构是通过使用本文所述的稀释剂进行的。

33、在一些实施方式中，所述组合物可单独或与载体如药学上可接受的载体或生物相容性支架联合给药。

34、在一些实施方式中，所述组合物被配制成用于口服施用。在一些实施方案中，所述组合物是肠溶制剂。在一些实施方案中，所述肠溶制剂是具有肠溶包衣的剂型。例如，肠溶制剂可以是肠溶颗粒、肠溶片或肠溶胶囊。在一些实施方式中，所述组合物是胶囊剂。在一些实施方式中，所述胶囊剂是硬胶囊或软胶囊；或者所述胶囊剂是缓释胶囊、控释胶囊或肠溶胶囊，或者所述胶囊剂可是微封装胶囊、或微胶囊。

35、在一些实施方案中，所述组合物为药物，或保健品或食品。

36、在一些实施方案中，所述组合物为婴儿适用剂型、儿童适用剂型或成人适用剂型。

37、在一些实施方案中，所述组合物为经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型。

38、第三方面，提供了第一方面所述的克里斯滕森菌或第二方面所述的组合物在制备用于治疗、预防或缓解代谢性疾病或代谢障碍引起的疾病的药物、保健品或食品中的应用。

39、在一些实施方案中，所述代谢性疾病、代谢障碍、或代谢障碍引起的疾病包括但不限于：肝脏类疾病、肥胖及肥胖类相关疾病、心血管疾病、糖尿病、血脂异常、心脑血管疾病、葡萄糖不耐受、动脉粥样硬化、冠心病或高血压、i型糖尿病、ii型糖尿病、糖耐量受损、胰岛素抵抗、肥胖症、高血糖症、高胰岛素血症、脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、高胆固醇血症、高血压、高脂蛋白血症、高脂血症、高甘油三酯血症、尿毒症、酮症酸中毒、低血糖、血栓性疾病、血脂异常、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、动脉粥样硬化、肾病中的至少一种。

40、在一些实施方案中，所述肝脏类疾病包括但不限于：脂肪肝、nafld/nash、肝功能异常、肝外胆汁淤积、肝炎、肝损伤、肝内胆汁淤积、肝纤维化、肝硬化和肝癌中的至少一种。

41、在一些实施方案中，本技术的克里斯滕森菌可用于治疗或预防肝脏功能损伤相关疾病，所述肝脏功能损伤相关疾病包括如下疾病中的至少一种：脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌。

42、在一些实施方案中，所述肝脏类疾病的诱因包括但不限于：高脂饮食、高胆固醇饮食、高糖饮食、高血脂、高血糖或高胆固醇中的至少一种。

43、在一些实施方案中，所述肝脏类疾病包括高脂饮食引起的、高胆固醇饮食引起的、高糖饮食引起的、高脂高胆固醇引起的、高脂高糖引起的和/或高脂高胆固醇高糖引起的。

44、在一些实施方案中，本技术所述的克里斯滕森菌能用于治疗、预防或缓解肝脏功能损伤相关疾病，所述肝脏功能损伤相关疾病包括如下中的至少一种：脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌。

45、在一些实施方案中，所述肥胖及肥胖类相关疾病包括但不限于：超重、肥胖症、代谢综合征、心血管疾病、心脑血管疾病、高脂血症、高胆固醇血症、高血压、胰岛素抗性综合征、肥胖相关的胃食管返流症、脂肪性肝炎。

46、在一些实施方案中，所述肥胖及肥胖类相关疾病的诱因包括但不限于：高脂饮食、高糖饮食、高胆固醇、高血脂、高血糖、nafld或nash中的至少一种。

47、在一些实施方案中，所述肥胖及肥胖类相关疾病包括但不限于：高脂饮食引起的肥胖、高胆固醇引起的肥胖、高糖饮食引起的肥胖、高脂高胆固醇引起的肥胖、高脂高糖引起的肥胖、高脂高胆固醇高糖引起的肥胖，或者，nafld或nash患者的肥胖。

48、在一些实施方案中，所述肥胖及肥胖类相关疾病包括如下中的至少一种：肥胖症、代谢综合征、心血管疾病、高脂血症、高胆固醇血症、高血压、胰岛素抗性综合征、肥胖相关的胃食管返流症和脂肪性肝炎。

49、在一些实施方案中，所述肥胖及肥胖类相关疾病包括如下中的至少一种：肥胖症、代谢综合征、心血管疾病、高脂血症、高胆固醇血症、高血压、胰岛素抗性综合征、肥胖相关的胃食管返流症和脂肪性肝炎。

50、在一些实施方案中，所述心血管疾病或心脑血管疾病包括但不限于：动脉粥样硬化、冠心病、nafld或nash患者的心血管疾病、nafld或nash患者的心脑血管疾病、高胆固醇疾病。

51、在一些实施方案中，所述心血管疾病或心脑血管疾病的诱因包括但不限于：动脉粥样硬化、nafld、nash、高血脂、高血糖或高胆固醇中的至少一种。

52、在一些实施方案中，所述糖尿病包括但不限于：i型糖尿病、ii型糖尿病、妊娠糖尿病、hdac活性介导的糖尿病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病、糖尿病眼睛病变、糖尿病性视网膜病、糖尿病足、胰岛b细胞受损引起的糖尿病、胰岛素耐性引起的糖尿病、肥胖引起的的糖尿病。

53、在一些实施方案中，所述糖尿病的诱因包括但不限于：胰岛细胞功能障碍、胰岛素分泌下降、胰岛素抵抗增加、高脂饮食、高糖饮食、高胆固醇、高血脂、高血糖、nafld或nash中的至少一种。

54、在一些实施方案中，所述糖尿病的诱因包括以下至少一种：高脂饮食引起的、高糖饮食引起的、高胆固醇饮食引起的。

55、在一些实施方案中，所述糖尿病表现为低水平的胰岛素和/或外周胰岛素抵抗导致的高血糖症。

56、在一些实施方案中，所述代谢障碍包括但不限于：(1)糖代谢紊乱引起的糖尿病，或(2)糖耐量异常或糖耐量降低引起的糖尿病，或(3)胰岛素b细胞受损引起的糖尿病，或(4)胰岛素抵抗引起的糖尿病。

57、在一些实施方案中，本技术的所述克里斯滕森菌具有提高胰高血糖素样肽-1(glp-1)的分泌水平，从而调节机体血糖平衡，改善机体葡萄糖耐量，进一步改善机体的胰岛素敏感性和瘦素敏感性，进而实现预防和/或治疗糖尿病和/或高血脂症的作用。

58、在一些实施方案中，所述药物或保健品或食品具有选自如下的至少一种效果：

59、减少肝脏重量；

60、治疗初期脂肪肝炎病灶；

61、减缓肝脏细胞脂肪堆积；

62、降低血清ast、alt；

63、减少腹部白色脂肪炎症性病变；

64、减轻哺乳动物的体重；

65、减少哺乳动物的摄食量；

66、降低哺乳动物的体脂；

67、降低哺乳动物血清中如下至少一种指标的水平：总胆固醇水平、低密度脂蛋白和甘油三酯水平；

68、提高哺乳动物血清高密度脂蛋白的水平；

69、改善哺乳动物口服葡萄糖耐量受损；

70、降低哺乳动物的空腹血糖；

71、降低哺乳动物homa ir指标；

72、修复消化道黏膜损伤；

73、治疗、预防或缓解冠心病；

74、治疗、预防或缓解动脉粥样硬化；

75、治疗、预防或缓解高血糖；

76、治疗、预防或缓解高血脂；

77、治疗、预防或缓解高胆固醇；

78、治疗、预防或缓解肝功能损伤；

79、治疗、预防或缓解脂肪肝；

80、治疗、预防或缓解nafld或nash；

81、治疗、预防或缓解高血压；

82、治疗、预防或缓解糖尿病，优选为妊娠糖尿病或ii型糖尿病或hdac活性介导的糖尿病；

83、治疗、预防或缓解肥胖症；

84、治疗、预防或缓解代谢综合征；

85、治疗、预防或缓解局部皮脂过多、腹股沟脂肪过度、附睾脂肪过多和/或棕色脂肪过多。

86、第四方面，本技术提供了克里斯滕森菌(christensenella sp.)、其培养物或其代谢产物在制备glp-1受体激动剂中的应用，所述克里斯滕森菌具有选自如下的一种或者多种特征：

87、与seq id no.3所示的序列至少99％同一性的16s rdna序列；

88、所述克里斯滕森菌为革兰氏染色阴性。

89、优选地，所述克里斯滕森菌包括保藏编号为gdmcc no：61117的菌株。

90、优选地，所述克里斯滕森菌的培养物为克里斯滕森菌株的培养上清液或克里斯滕森菌的发酵上清液。

91、优选地，所述克里斯滕森菌为小肠克里斯滕森菌(christensenellaintestinihominis)。

92、第五方面，本技术提供了克里斯滕森菌(christensenella sp.)、其培养物或其代谢产物在制备dpp4(dppiv)抑制剂中的应用，所述克里斯滕森菌具有与seq id no.3所示的序列至少99％同一性的16s rdna序列；所述克里斯滕森菌革兰氏染色阴性。

93、优选地，所述克里斯滕森菌包括保藏编号为gdmcc no：61117的菌株；

94、优选地，所述克里斯滕森菌的提取物为克里斯滕森菌的培养上清液或克里斯滕森菌株的发酵上清液或克里斯滕森菌株的次级代谢产物。

95、优选地，所述克里斯滕森菌可选为小肠克里斯滕森菌(christensenellaintestinihominis)。

96、第六方面，本技术提供了克里斯滕森菌(christensenella sp.)、所述组合物、所述glp-1受体激动剂或所述dpp4(dppiv)抑制剂在制备用于通过调节脂肪组织代谢和/或葡萄糖稳态而增加受试者的能量消耗的组合物中的应用。

97、优选地，所述克里斯滕森菌、所述组合物、所述glp-1受体激动剂或所述dpp4(dppiv)抑制剂不影响受试者食物摄入，更优选地，不影响受试者食物摄入量。

98、优选地，所述组合物是营养组合物。

99、优选地，所述克里斯滕森菌、所述组合物、所述glp-1受体激动剂或所述dpp4(dppiv)抑制剂呈食物添加剂、饮食补充剂、营养品或医疗食品的形式。

100、第七方面，本技术提供了克里斯滕森菌(christensenella sp.)、所述组合物、所述glp-1受体激动剂或所述dpp4(dppiv)抑制剂在制备用于促进受试者的体重减轻的组合物中的应用。

101、优选地，所述克里斯滕森菌、所述组合物、所述glp-1受体激动剂或所述dpp4(dppiv)抑制剂不影响受试者食物摄入，更优选地，不影响受试者食物摄入量。

102、优选地，所述组合物是营养组合物。

103、优选地，所述克里斯滕森菌、所述组合物、所述glp-1受体激动剂或所述dpp4(dppiv)抑制剂呈食物添加剂、饮食补充剂、营养品或医疗食品的形式。

104、第八方面，本技术提供了克里斯滕森菌(christensenella sp.)、所述组合物、所述glp-1受体激动剂或所述dpp4(dppiv)抑制剂在促进受试者的体重减轻中的应用；所述克里斯滕森菌革兰氏染色阴性。

105、优选地，所述克里斯滕森菌、所述组合物、所述glp-1受体激动剂或所述dpp4(dppiv)抑制剂不影响受试者食物摄入，更优选地，不影响受试者食物摄入量。

106、优选地，所述组合物是营养组合物。

107、优选地，所述克里斯滕森菌、所述组合物、所述glp-1受体激动剂或所述dpp4(dppiv)抑制剂呈食物添加剂、饮食补充剂、营养品或医疗食品的形式。

108、在一些实施方案中，所述克里斯滕森菌、所述组合物、所述glp-1受体激动剂或所述dpp4(dppiv)抑制剂与另一种或多种益生菌和/或与一种或多种益生元共同施用。

109、第九方面，本技术提供了用于增加受试者能量消耗的克里斯滕森菌，或包含克里斯滕森菌(christensenella sp.)、培养物或其代谢产物的组合物，所述克里斯滕森菌选自第一方面的克里斯滕森菌(christensenella sp.)，所述组合物选自第二方面的组合物。

110、优选地，所述克里斯滕森菌或所述组合物不影响受试者食物摄入，更优选地，所述克里斯滕森菌或所述组合物不影响受试者食物摄入量。

111、优选地，所述组合物是营养组合物；

112、优选地，所述克里斯滕森菌或所述组合物呈食物添加剂、饮食补充剂、营养品或医疗食品的形式。