一株猪德尔塔病毒致弱毒株PDCoVCH/XJYN-P240/2016及其应用

本发明属于生物制品，具体涉及一株猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016及其应用。

背景技术：

1、猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus，pdcov)是一种新发的猪肠道冠状病毒，属于套式病毒目(niovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、德尔塔冠状病毒属(deltacoronavirus)成员(heet al.，2020)。pdcov能够感染不同日龄的猪，其中哺乳仔猪最易感，临床症状主要表现为精神萎靡、食欲不振、呕吐、持续腹泻以及严重脱水(chen etal.，2015；jung et al.，2015)。与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus，pedv)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，tgev)相似，pdcov主要感染猪小肠上皮细胞并导致显著的绒毛萎缩(wang et al.，2019)。但相比于pedv和tgev，pdcov在哺乳仔猪中所导致的临床症状严重程度及死亡率(约40％-80％)都相对较低(song et al.，2015)。

2、近年来国内外的相关研究结果显示pdcov除了能感染猪之外还可以感染犊牛和家禽，并且能够在家禽中引起腹泻症状(liang et al.，2019)。此外，现有技术报道，pdcov具有跨物种传播的内在潜力，是一种潜在的高风险新冠病毒病原体(li et al.，2018)。

3、pdcov是一种含囊膜的单股正链rna病毒，基因组全长约25.4kb，包含5'和3'非翻译区及至少7个开放性阅读框，分别编码多聚酶蛋白(polymerase protein)1a/1b、纤突蛋白(spike，s)、包膜蛋白(envelope，e)、膜蛋白(membrance，m)、核衣壳蛋白(nucleocapsid，n)、非结构蛋白6(nonstructural protein 6，ns6)及非结构蛋白7(nonstructuralprotein 7，ns7)(ma et al.，2015；marthaler et al.，2014)。其中s蛋白在病毒和细胞受体融合，诱导机体产生中和抗体方面发挥重要作用，是主要的抗原蛋白，具有高度的免疫原性(kirchdoerfer et al.，2021；liu et al.，2021；tortorici et al.，2022)。

4、鉴于tgev和pedv的防控策略依赖于“肠道-乳腺-siga轴”途径，因此推测该途径同样适用于pdcov(langel et al.，2016)。研究表明相比于灭活疫苗，弱毒活疫苗能更好的激活“肠道-乳腺-siga轴”途径，诱发高水平的siga抗体(kao et al.，2018)。但目前尚没有针对pdcov的商品化弱毒活疫苗。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一株猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016，在pdcov ch/xjyn/2016毒株的基础上经过传代至240代，能使毒株完全致弱，且具有良好的遗传稳定性，为研制pdcov活疫苗提供了良好的候选毒株。

2、本发明提供了一株猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016，保藏编号为cgmcc no.45211。

3、本发明提供了所述猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016在制备防控流行性腹泻的活疫苗中的应用。

4、本发明提供了一种防控由猪德尔塔病毒引起的猪腹泻病活疫苗，包括所述猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016和佐剂。

5、优选的，所述猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016的滴度为108.2tcid50/ml～108.9tcid50/ml。

6、本发明提供了一种包含所述猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016的s基因的重组载体。

7、本发明提供了一种工程菌株，包括所述猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016的s基因或所述重组载体。

8、本发明提供了一种利用所述工程菌株表达的重组s蛋白。

9、本发明提供了所述s蛋白在制备防控由猪德尔塔病毒引起的猪腹泻病亚单位疫苗中的应用。

10、优选的，所述流行性腹泻的对象包括以下至少一种：猪、牛、鸡、鸭、鹅、鹌鹑和鸽。

11、本发明提供了一种防控由猪德尔塔病毒引起的猪腹泻病亚单位疫苗，包括所述重组s蛋白和佐剂。

12、本发明提供了一株猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016，保藏编号为cgmcc no.45211，是pdcov ch/xjyn/2016毒株(genbank accession number:mn064712)在llc-pk细胞上进行了连续传代至240代得到。所述猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016对哺乳乳猪无致病性，在免疫0～7天内仔猪状态良好，未发现腹泻症状，且未检测到粪便中病毒rna存在，且免疫后的仔猪肠道未发生明显病变，且未检测到十二指肠、空肠及回肠的肠上皮细胞上存在猪德尔塔病毒抗原。攻毒保护实验结果表明，猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016具有良好的攻毒保护能力，攻毒21天后免疫仔猪精神、粪便均未见异常，100％健活，保护率为5/5。免疫仔猪的毒株经过传代5代，未见明显病变，说明该毒株无毒力返强现象。此外，毒株在细胞上的增殖稳定性和增殖滴度实现表明，p240毒株感染细胞后产生更加明显的细胞病变；同时生长动力曲线显示p240的病毒滴度在感染后48h达到峰值，早于p10毒株到达峰值的时间，表明p240具有更好的细胞适应性。这些结果表明pdcov ch/xjyn/2016株在体外连续传代过程中对llc-pk细胞的敏感性和适应性逐渐增强。可见，所述猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016具有良好的细胞易感性和良好的复制性，同时免疫乳猪不会产生明显的致病性，为防控由猪德尔塔病毒引起的猪腹泻病的活疫苗的制备提供了良好的候选毒株。

技术特征：

1.一株猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016，其特征在于，保藏编号为cgmcc no.45211。

2.权利要求1所述猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016在制备防控由猪德尔塔病毒引起的猪腹泻病活疫苗中的应用。

3.一种防控由猪德尔塔病毒引起的猪腹泻病活疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016和佐剂。

4.根据权利要求3所述防控由猪德尔塔病毒引起的猪腹泻病活疫苗，其特征在于，所述猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016的滴度为108.2tcid50/ml～108.9tcid50/ml。

5.一种包含权利要求1所述猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016的s基因的重组载体。

6.一种工程菌株，其特征在于，包括权利要求1所述猪德尔塔病毒致弱毒株pdcov ch/xjyn-p240/2016的s基因或权利要求5所述重组载体。

7.一种利用权利要求6所述工程菌株表达的重组s蛋白。

8.权利要求7所述重组s蛋白在制备防控由猪德尔塔病毒引起的猪腹泻病亚单位疫苗中的应用。

9.根据权利要求2或8所述应用，其特征在于，所述由猪德尔塔病毒引起的猪腹泻病对象主要是猪。

10.一种防控由猪德尔塔病毒引起的猪腹泻病亚单位疫苗，其特征在于，包括权利要求7所述重组s蛋白和佐剂。

技术总结本发明提供了一株猪德尔塔病毒致弱毒株PDCoV CH/XJYN/2016‑P240及其应用，属于生物制品技术领域。本发明提供了一株猪德尔塔病毒致弱毒株PDCoV CH/XJYN‑P240/2016，保藏编号为CGMCC No.45211，是PDCoV CH/XJYN/2016毒株(MN064712)在LLC‑PK细胞上进行了连续传代至240代得到。所述致弱毒株在LLC‑PK细胞上具有较强的适应性和良好的复制特性，且对免疫动物无致病性，具有良好的攻毒保护作用，且无毒力返强现象，保证后续制备活疫苗的安全性，同时填补了用于防控由猪德尔塔病毒引起的猪腹泻病活疫苗的空白。技术研发人员：刘新生,张莉萍,王永录,方玉珍,周鹏,张永光,于瑞明,潘丽,张中旺,郭慧琛受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所技术研发日：技术公布日：2024/9/29