一种酶促核酸可控阵列合成装置及方法与流程

本发明涉及核酸合成领域，本发明提出一种基于酶促核酸合成原理的可控阵列合成方法，可在一套反应循环中进行多条核酸单链定制序列的酶促法平行合成。本发明还涉及用于酶促合成方法的核苷酸其3’端羟基保护基团的合成原理路线，可控合成阵列芯片装置结构、制备和使用方法，以及合成后的产物回收方法。

背景技术：

1、核酸人工可控合成分为化学法与生物酶促法。化学法主要采用固相亚磷酰胺三酯四步合成法。在化学法中，一个新的亚磷酰胺核苷(dntp)的5’端羟基(-oh)被保护基团封闭，而其3’端经活化后可与核酸链末端核苷酸的5’端羟基(-oh)偶联，之后，将亚磷基团氧化为五价磷，完成一次链的5’端向3’端的延伸。由于新添加的核苷酸5’端-oh被保护基团封闭，无法发生与下一个核苷偶联的反应。控制核酸链末端核苷保护基团的去除和新添加核苷的种类，即可对该链实现定制序列的可控合成。生物酶促法的原理是末端转移酶(terminal transferase，tdt)催化的核酸延伸反应。不同于聚合酶，tdt可以不依赖模板合成脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,dna)或者核糖核酸(ribonucleic acid,rna)，或其它掺入各种特殊标记的核苷酸。酶促法的可控合成原理同化学法，不同的是，其核苷酸的添加方向是3’端向5’端延伸。

2、核酸阵列合成技术是建立在较为成熟的核酸可控合成方法上，利用阵列平行合成提高合成通量的商业化策略。核苷酸阵列合成技术根据不同的核苷酸脱保护基团机理，主要分为光化学法、电化学法、喷墨打印法、热敏法、压印法以及微流控等技术路线。现有的核酸阵列芯片合成方法是基于已经成熟应用于工业界的固相亚磷酰胺化学合成法，此方法涉及大量的有机试剂，且要求无水、惰性气体环境，条件苛刻、所用试剂污染环境。酶促法合成核酸，反应条件相对温和，使用水系试剂，相对更加环保，然而酶促法阵列合成尚处于起步阶段，并没有形成成熟的商业化方法。

3、相比于现有的核酸合成阵列芯片(如：wo2006113554a2以及nguyen b h,takahashi c n,gupta g,et al.scaling dna data storage with nanoscale electrodewells.science advances,2021,7(48):eabi6714.)，本发明采用了一种新的核苷酸封闭策略，将其应用于酶促法核酸阵列合成。本方法制备的被修饰的核苷酸，可结合阵列芯片装置，通过电致酸的脱保护机制控制核苷酸的逐个添加。在一次核苷酸偶联反应循环中，同时进行多个不同定制序列的平行合成，提高了合成的通量。通过提高所加工的阵列芯片的电极密度，可以进一步提高该合成装置的合成通量，实现高通量的核酸酶促法合成。

4、核苷酸3’端-oh的保护基团，已存在如丙烯基(taek-soo kim；da-rae kim；hee-chul ahn；dongyun shin；dae-ro ahn(2010).novel3′-o-fluorescently modifiednucleotides for reversible termination of dna synthesis.,11(1),75–78；唐剑耀,刘红星,黄初升.烯丙基醚脱烯丙基保护研究进展，化工技术与开发,2016(2):5.)，叠氮基团(us10059929b2)等，通过碱性试剂处理可以被脱掉。例如，当3’端用丙烯基(如图1)保护时，使用na2pdcl4tppts在70℃条件下处理90秒可以脱掉该保护基团，但反应的效率较低。又例如，用nai/dmso在130℃条件下脱去保护基团，可以达99％的高产率，但此方法需要高温等苛刻条件。也有公司用了一种用酸脱保护的方法(cn107074903a)，如用350～700mm浓度的nano2与naoac，ph5.5的溶液进行处理，室温下，将反应暴露于365nm紫外光下温育1～2分钟，通过添加浓度为1m、ph7.0的磷酸盐缓冲液并停止照射来终止反应。然而，这种核苷酸的结构和脱保护的操作都较为复杂。当3’端-oh用对二甲氧基三苯甲基(dmtr)(如图2)或者对甲氧基三苯甲基(mmtr)作为保护基团时，该基团可以用酸性试剂脱去，反应时间相比上述碱性试剂条件更短。目前市面上已有3’端dmtr保护的胸腺嘧啶核苷酸产品。另有工作使用伯胺(-nh2)作为保护基团取代3’端-oh的氢，在酸性环境中-onh2转换为-oh，使得延伸反应可以发生(us2020041643a1)。

技术实现思路

1、本发明具体的技术方案如下：

2、本发明第一方面提供一种基于流体控制和集成电路控制的核酸阵列芯片合成装置，该装置包括自上而下的流体控制芯片层、电极阵列芯片层和电路控制芯片层，

3、流体控制层包含入口缓冲区、反应区和出口缓冲区；入口、出口缓冲区与多个储液区单元相连，通过气体或蠕动泵驱动液体，实现反应区内不同溶液的置换；

4、电极阵列芯片层由微机电系统(mems)工艺制备的电极或由mems电极和互补金属氧化物半导体(cmos)工艺制备的集成电路部分组成，其中电极阵列的区域与流体控制层反应区对准，电极阵列芯片层与流体控制层通过胶连封装或键合方式连接；

5、控制芯片层为印制电路板(pcb)，通过引脚封装与电极阵列芯片层连接，控制芯片层连接外部控制电路和操作系统，通过程序实现阵列芯片中单个电极位点的独立控制。

6、在本发明具体的实施方式中，所述流体控制芯片层与外部气液驱动连接方式如下：该层与若干个储液区单元相连，每个储液区单元由进样阀门，储液腔和出样阀门构成，进、出样阀门可配合蠕动泵负压控制液体向反应区的输送，也可连接压缩空气或惰性气体气路，通过气压正压控制储液腔中液体向反应区的输送，气体优选氮气、氩气；储液区单元向反应区输入清洗溶剂、脱保护试剂、反应物溶液(例如a、t、c、g四种脱氧核糖核苷酸)和气体，相应物质通过入口缓冲区进入反应区，完成反应步骤后，由气体或清洗溶剂通过出口缓冲区进入反应物回收储液区单元或废液区。

7、在本发明具体的实施方式中，电极阵列芯片包括芯片基底、若干个独立的电极位点以及可独立控制单个电极位点的引线；其中，若干独立的电极位点组成电极阵列，阵列周期在亚微米至亚毫米级，形状可以是且不限于圆形、椭圆形、多边形、环形等；根据电极的尺寸、电极阵列密度与加工工艺的兼容性，电极位点和引线的结构可以是单层或多层；根据引线的结构和数量，芯片的连接和控制方式可以是引线的引脚直接连接pcb板、或通过微纳米加工后道工序整合在底层cmos芯片上，并通过程序实现电极位点的可寻址、独立控制。

8、在本发明具体的实施方式中，电路控制芯片层通过定制化的程序控制电极阵列芯片层中每个电极位点的电位，通过电位的开启和关闭，实现该位点及附近区域内化学反应的发生。

9、在本发明具体的实施方式中，电极芯片表面修饰含有伯碳-oh的功能涂层，包括但不限于巯基醇、氨基醇，各种糖类等。

10、本发明第二方面提供基于上述核酸阵列芯片合成装置的核酸阵列合成方法，包括如下步骤：

11、1)通过电极芯片表面的功能性修饰实现核酸起始序列在电极上的固相连接；优选的，起始序列长度一般不少于三个碱基或碱基对，由第一个核苷酸的5’端的三磷酸基团与功能涂层上的伯碳-oh缩合连接到芯片表面；优选地，起始序列可以是双链或者单链，可以含有特定的限制性酶切位点，使得合成完成后的核酸链可使用限制性内切酶酶切，或者含有特定的突变rna碱基，以便用核酸内切酶rnaseh2剪切rna碱基；

12、2)电脱保护步骤：储液区单元向反应区、输送清洗溶剂如超纯水，清洗后溶剂经由缓冲区进入废液区；之后，储液区单元向反应区输送电致酸溶液如含有10mm对苯二酚与5mm对二苯醌的水溶液并经由缓冲区进入废液区；待反应区中液体被充分置换为电致酸溶液时，关闭进出液阀门，在电路控制程序中选择需要施加电压的电极单元位点，向已选电极位点上施加正电压，电致酸溶液中的对苯二酚等能够电解出氢离子的物质失电子被氧化，释放出氢离子，造成该电极位点附近的局部液体环境呈酸性；当局部酸性环境的ph值低于dmtr基团被脱除所需的阈值时，固定在电极位点上的核酸末端核苷酸3’端的dmtr保护基团被脱去，暴露出该核苷酸3’端的-oh，使其具有了偶联活性；同时，未被施加电压的电极单元位点，其附近的局部液体环境ph值高于dmtr基团被脱除所需的阈值，无法使该位点上末端核苷酸3’端的dmtr保护基团被脱去，因此无法在下述处理时发生延伸反应；

13、3)脱保护步骤之后，储液区单元中的某一独立单元向反应区、输送tdt酶与3’端被dmtr封闭的单一种类核苷酸(dntp)的混合反应体系溶液，输送完毕后关闭单元进出阀门；将混合液体在37℃保存15分钟，tdt酶与被封闭的dntp与反应区中特定位点上已脱去保护基团核酸单链发生反应，即tdt酶使dntp与单链上游离的3’端-oh耦合，完成一次核苷酸的添加；

14、4)储液区单元向反应区输送气体，将反应后剩余的酶与核苷酸混合溶液经由出口缓冲区送入回收储液区单元中特定的独立单元，与储液区单元类似，回收储液区也包含多个独立单元，每一种核苷酸的溶液分别被回收至单独的储液区单元中；

15、5)任选地终止步骤，由储液区单元另一独立单元向反应区输入0.5m的edta终止反应，或者将反应区加热到70℃保存10分钟，使反应体系失活；

16、6)储液区单元向反应区、输送清洗溶剂，清洗后经由缓冲区进入废液区；

17、7)重复上述脱保护步骤与延伸步骤，直到完成所有种类碱基各一次的合成，至此在电极阵列芯片上完成一次所有核酸链延伸的循环；重复此循环，直到完成该芯片上所设计的最长序列的合成。

18、在本发明具体的实施方式中，其中步骤2)还包括任选地酸脱保护步骤：

19、2-1)储液区单元向反应区、输送清洗溶剂如超纯水，清洗后溶剂经由缓冲区进入废液区；之后，储液区单元向反应区输送酸性溶液如三氯乙酸并经由缓冲区进入废液区；待反应区中液体被充分置换为酸性溶液时，关闭进出液阀门，固定在反应区内的核酸末端核苷酸3’端的dmtr保护基团被脱去，暴露出该核苷酸3’端的-oh，使其具有了偶联活性，可以发生链延伸反应。

20、在本发明具体的实施方式中，其中步骤7)之后还任选包含步骤：

21、8)将荧光探针通过与合成的核酸链互补杂交，可以在阵列芯片上对每个电极位点的合成序列实现可寻址的合成准确度检测；或通过直接在特定单元电极上的核酸链末端合成荧光基团，通过荧光显微镜观察信号分布与强弱评估合成效果。

22、在本发明具体的实施方式中，其中步骤8)之后还任选包含步骤：

23、9)将合成的序列从电极阵列芯片上切割下来；或合成完成后通过加热变性打开双链，直接回收合成的单链。

24、在本发明具体的实施方式中，步骤9)中包括：当核酸链通过双链互补方式连接在电极芯片表面时，在预先引入的酶切位点处用限制性内切酶剪切，保留酶切位点可直接用于下一次合成时的连接；或通过rnaseh2将预先引入的rna突变碱基切除降解，合成完成后通过加热变性直接打开双链，直接回收合成的单链。

25、发明的有益效果

26、与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：

27、本方法制备的核苷酸，可结合阵列芯片装置，通过电致酸的脱保护机制控制单个核苷酸的添加。相对现有基于化学法的核酸合成阵列芯片方法，酶促法合成核酸，反应条件相对温和，反应效率更高，且使用水系试剂，相对更加环保。在一次核苷酸偶联反应循环中，同时进行多个不同定制序列的平行合成，提高了合成的通量。通过提高所加工的阵列芯片的电极密度，可以进一步提高该合成装置的合成通量，实现高通量的核酸酶促法合成。