一种靶向GPC-3蛋白的多肽偶联化合物的制备方法及应用

本发明涉及医药，具体地说，是一种靶向gpc-3蛋白的多肽偶联化合物的制备方法及应用。

背景技术：

1、在健康的细胞中，特定数量的蛋白质在特定的时间以特定的方式折叠，形成特定的三维复合结构发挥作用。但这种平衡可能被各种打破——细胞压力、基因突变、转录或翻译错误等事件会导致蛋白质在细胞的过表达、生产速度异常、折叠错误或突变，当蛋白质过表达或突变时，就会导致各类疾病。癌症的发生发展很多时候由于某个蛋白生物标志物水平过高，因此靶向蛋白降解变成一种极具前景的肿瘤治疗策略。

2、溶酶体靶向嵌合体因对膜蛋白具有一定的降解作用，近年来备受研究人员关注。然而目前开发的溶酶体靶向嵌合体通常是基于抗体或核酸适配体，分子量大、合成困难、成药性低是其主要缺陷。同时，可供选择的溶酶体靶向受体十分有限。

3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypicans-3，gpc-3)是近年来研究较多的原发性肝癌肿瘤标志物，它是一种蛋白多糖，通过磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上。本研究发现，在肝癌等癌细胞中有特异性分布的gpc-3蛋白，具有内吞并定位至溶酶体的效应。通过将pd-l1蛋白配体bms-202与靶向gpc-3的多肽通过连接子进行连接，我们构造了一类基于gpc-3蛋白介导，通过内吞膜蛋白至溶酶体发挥pd-l1蛋白降解活性的化合物。这类化合物可通过gpc-3蛋白介导，靶向降解pd-l1蛋白，具有潜在的肿瘤治疗作用。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，克服现有药物治疗的缺陷，提供一种靶向gpc-3蛋白的多肽偶联化合物。

2、为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

3、一种靶向gpc-3蛋白的多肽偶联化合物，所述的靶向gpc-3蛋白的多肽偶联化合物为具有式(1)结构的化合物或其药学上可接受的多肽：

4、

5、其中，x为任意具有靶向gpc-3蛋白能力的多肽，包括但不仅限于以下多肽序列：d-y-e-m-h-l-w-w-g-t-e-l、d-h-l-a-s-l-w-w-g-t-e-l、s-n-d-r-p-p-n-i-l-q-k-r、r-l-n-v-g-g-t-y-f-l-t-t-r-q、k-k-k-r-l-n-v-g-g-t-y-f-l-t-t-r-q、t-h-v-s-p-n-q-g-g-l-p-s、a-l-l-a-n-h-e-e-l-f-q-t、q-l-e-l-t-f-h-a-n-l-e-a；

6、y为任意具有靶向pd-l1蛋白能力的小分子化合物或多肽，包括但不仅限于pd-l1小分子抑制剂bms-202，其具有式(2)结构：

7、

8、式(2)；所述连接子用于将-nh和y进行连接。连接子包括但不限于下列结构：

9、其中n＝0,1,2,3或4。

10、具体地，

11、n＝0，连接子结构为

12、n＝1，连接子结构为

13、n＝2，连接子结构为

14、n＝3，连接子结构为

15、n＝4，连接子结构为

16、在另一方面，本发明提供一种上述的靶向gpc-3蛋白的多肽偶联化合物的方法，该方法包括以下：

17、(1)合成化合物8：

18、

19、以n-boc乙二胺为原料，在edci,hobt,dipea催化条件下与5-乙炔酸反应酰胺化得到化合物3，化合物3在hcl作用下脱boc得到化合物4；3-羟甲基-2-甲基联苯在cs2co3,t-buxphos,pd(oac)2,催化条件下与6-氯-2-甲氧基烟醛反应得到化合物7；化合物7在dipea、stab条件下与化合物4反应得到化合物8；

20、(2)采用标准的芴甲氧羰基(fmoc)固相多肽合成(spps)方法，以2-氯三苯甲基氯树脂为原料，添加带fmoc保护的氨基酸、化合物8以合成所述的靶向gpc-3蛋白的多肽偶联化合物：

21、

22、所述步骤(2)中靶向gpc-3蛋白的多肽偶联化合物的具体合成步骤为：，以2-氯三苯甲基氯树脂为固体支持物，20％的无水哌啶dmf(v/v)溶液对fmoc保护基进行脱保护，使用hobt和dic作为偶联剂，将脱保护树脂与氨基酸(2.0eq.)在无水dmf中于30°c下偶联，使用茚三酮法确认每个偶联步骤的完成，将最终氨基酸与树脂偶联后，得到化合物9,氨基酸加入顺序即多肽序列顺序；使用20％的无水哌啶dmf(v/v)溶液脱去化合物9的fmoc保护基团，得到化合物10，该化合物10为一种连接在树脂上的多肽；以hatu和dipea 为偶联剂，将叠氮-pegn-酸化合物(2.0当量)依次与化合物10偶联,得到化合物11；为使肽衍生物从树脂中切除，使用三氟乙酸将化合物从树脂上分离然后过滤，将所得滤液倒入冷乙醚中，形成大量白色沉淀，离心收集沉淀；沉淀用冷乙醚洗涤2-3次，得到化合物12。最后，通过简单的点击反应，将化合物12、化合物8、cuso4和抗坏血酸钠混合，在室温下反应5小时，并通过hplc进行纯化，得到化合物13。

23、第三方面，本技术还涉及所述的靶向gpc-3蛋白的多肽偶联化合物基于gpc-3蛋白介导，通过内吞至溶酶体降解pd-l1蛋白在制备预防和/或治疗与gpc-3表达和pd-l1表达相关疾病的药物中的用途。在某些实施例中，所述与gpc-3表达和pd-l1表达相关疾病包括肝癌。

24、本发明的有益效果：

25、靶向蛋白降解技术是重要的药物研发策略。溶酶体靶向嵌合体因对膜蛋白具有一定的降解作用，近年来备受研究人员关注。然而目前开发的溶酶体靶向嵌合体通常是基于抗体或核酸适配体，分子量大、合成困难、成药性低是其主要缺陷。同时，可供选择的溶酶体靶向受体十分有限。申请人发现在肝癌等癌细胞中有特异性分布的蛋白gpc-3，具有内吞并定位至溶酶体的效应，由此开发了gpc-3介导的溶酶体降解策略，在多种癌细胞中实现了pd-l1等多种癌症相关膜蛋白的降解。

26、靶向性不足是pd-l1小分子抑制剂所面临的主要问题之一，本发明将可与肝癌细胞肿瘤标志物gpc-3特异性结合的多肽与pd-l1小分子配体相连接获得本发明的目标化合物，即靶向gpc-3介导pd-l1溶酶体降解的多肽偶联化合物。本发明大部分化合物表现出良好的体外活性，其中化合物wp0的活性最优，对肝癌细胞hepg2和caco2的dc50值分别为0.38和0.55μm，对pd-l1蛋白进行抗体荧光标记，利用荧光共聚焦实验，考察wp0的原位pd-l1降解效应。wp0分子能显著降低细胞表面pd-l1蛋白荧光强度。

27、利用inf-γ刺激hepg2细胞，使其稳定表达pd-l1，利用离子霉素与佛波醇刺激jurkat细胞，使其稳定表达pd-1。将待测化合加入hepg2细胞中，作用24小时，再加入jurkat细胞进行共孵育，模拟效应t淋巴细胞识别并杀伤肿瘤细胞的效应，并利用cck-8实验检测hepg2细胞的存活率。wp0相较于pd-l1小分子抑制剂显著降低了化合物脱靶效应。上述实验表明，“挟持”gpc-3蛋白的双功能分子降解剂wp0，能够在多种细胞中实现pd-l1降解，具有潜在的肿瘤治疗作用。