中国菰ZlRc和ZlRd基因聚合在提高水稻种子多酚含量中的应用

本发明属于植物基因工程，具体涉及一种中国菰zlrc和zlrd基因聚合在提高水稻种子多酚含量中的应用。

背景技术：

1、多酚类化合物包括酚酸和类黄酮。稻米中的酚酸主要包括羟基苯甲酸和羟基肉桂酸类。类黄酮是由两个芳香环和一个杂环c3结构(c6-c3-c6)组成的一类化合物，由于杂环结构的差异性，类黄酮分为黄酮醇、黄酮、儿茶酚、黄烷酮、花青素和异黄酮六大类。类黄酮通常和一些糖类相连成糖苷形式而存在。在稻米中，类黄酮的含量和种类直接和稻米颜色相关，且不同品种的差异很大。大多数黑米中主要含有花青素，也有黑米中含有原花青素；大多数红米中主要含有原花青素，而不含花青素。水稻中的多酚类化合物具有广泛的生物活性，包括抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血糖和抗过敏活性等。富含多酚类化合物的有色稻米在医药和食品等领域具有重要的应用价值。

2、目前大多数栽培稻的颜色为白色，而大多数野生稻的颜色为红色，谷粒颜色一直是驯化过程中的一个重要目标，rc和rd的驯化就是对水稻种皮颜色的选择。已有的研究显示，红米主要受控于两个基因的表达——第七染色体上的rc和第一染色体上的rd。rc编码bhlh转录因子，rd编码二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase，dfr)。rc是水稻种皮原花青素生物合成的决定因素，且与rd基因存在互补作用，当只有rc存在时，水稻种皮呈棕色；当只有rd存在时，水稻种皮无颜色；当rc和rd同时存在时，水稻种皮才呈红色。

3、中国菰资源在中国十分丰富，研究表明，来自长江中下游地区的野生中国菰是一种良好的禾谷类作物驯化候选品种。中国菰的颖果称为中国菰米(chinese wild rice)，它是一种全谷物，其所含的酚酸和类黄酮等多酚类物质具有优异的抗氧化特性，是一种很有潜力的功能性食品原料。中国菰米富含多酚类化合物，其总多酚、总黄酮、总原花青素可达普通稻米的7倍、3倍、6倍，其抗氧化活性可达普通稻米的4倍。中国菰中的类黄酮生物合成关键基因包括结构基因和调控基因两类。其中，rc编码bhlh转录因子，为类黄酮生物合成调控基因；rd编码dfr，为类黄酮生物合成结构基因。因此，中国菰中酚类化合物合成关键调控基因和结构基因的发掘，对创制富含多酚的功能型稻米品种、改善居民膳食结构和降低造成慢性疾病的膳食风险因素都具有重要的现实意义和应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种中国菰zlrc和zlrd基因聚合在提高水稻种子多酚含量中的应用，本发明以提高水稻种子多酚含量为目的，分离和应用包含zlrc和zlrd基因的dna片段，利用组成型启动子驱动两段dna片段聚合超量表达zlrc和zlrd基因后时，水稻种子的多酚含量显著增加。

2、本发明的技术方案是：

3、中国菰zlrc和zlrd基因聚合在提高水稻种子多酚含量中的应用，所述zlrd基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述zlrc基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

4、进一步的，所述zlrd基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：5所示，所述zlrc基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：6所示。

5、进一步的，将构建的zlrc和zlrd基因聚合过表达载体转入水稻中，得到同时能够过表达zlrc和zlrd的转基因水稻。

6、进一步的，将zlrc和zlrd基因序列先后构建到过表达载体上，将所述过表达载体转入水稻中，通过提高zlrc和zlrd基因mrna的表达量而获得种子多酚含量显著提高的转基因水稻植株。

7、进一步的，将所述过表达载体通过化学转化方式转化到农杆菌中，通过农杆菌浸染愈伤组织的方式，获得独立转化体，通过植株再生，得到所述转基因水稻。

8、本发明的有益效果：

9、(1)本发明采用pcr技术，从中国菰cdna文库中分别扩增得到含有zlrc和zlrd基因编码序列的基因组dna片段，将这两段序列先后构建到pc2300s过表达载体上，利用该载体转化水稻，通过提高zlrc和zlrd基因的表达量而获得种子多酚含量显著提高的转基因水稻植株。

10、(2)本发明提供了中国菰zlrc和zlrd基因聚合在提高水稻种子多酚含量中的应用。本发明能够有效在水稻中聚合过表达zlrc和zlrd基因。在与对照植株生长环境一致的情况下zlrc和zlrd基因聚合水稻所收获的种子与对照组相比，具有更高的总酚、总黄酮和总原花青素含量以及更高的dpph自由基清除能力和abts·+自由基吸收能力。这说明zlrc和zlrd基因聚合过表达对水稻中多酚类化合物的合成途径具有有效调控作用，提高了转基因水稻种子中的多酚含量，并导致水稻种子由无色变为深棕色。

11、(3)本发明基于中国菰基因组测序结果，通过与水稻基因组进行共线性分析，在中国菰中克隆得到控制酚类化合物生物合成的结构基因zlrd。生物学功能验证表明，zlrc和zlrd基因聚合过表达导致转基因水稻种子多酚含量显著提升，本发明证实了中国菰zlrc和zlrd基因聚合在提高水稻种子多酚含量中的应用途径和方法。

技术特征：

1.中国菰zlrc和zlrd基因聚合在提高水稻种子多酚含量中的应用，其特征在于，所述zlrd基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述zlrc基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述zlrd基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：5所示，所述zlrd基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：6所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将构建的zlrc和zlrd基因聚合过表达载体转入水稻中，得到同时能够过表达zlrc和zlrd的转基因水稻。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将zlrc和zlrd基因序列先后构建到过表达载体上，将所述过表达载体转入水稻中，通过提高zlrc和zlrd基因mrna的表达量而获得种子多酚含量显著提高的转基因水稻植株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述过表达载体通过化学转化方式转化到农杆菌中，通过农杆菌浸染愈伤组织的方式，获得独立转化体，通过植株再生，得到所述转基因水稻。

技术总结本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种中国菰ZlRc和ZlRd基因聚合在提高水稻种子多酚含量中的应用，ZlRd基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，ZlRc基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的目的在于提高水稻种子多酚含量，能够同时在水稻中过表达ZlRc和ZlRd基因。在与对照植株生长环境一致的情况下，ZlRc和ZlRd基因聚合的水稻与对照组相比，水稻种子的颜色变为深棕色，水稻种子多酚含量显著提高。技术研发人员：闫宁,李宛鸿,马晴,林诺斯,陈曦,李亚丽,王丽霞,张洪博,张忠锋受保护的技术使用者：中国农业科学院烟草研究所（中国烟草总公司青州烟草研究所）技术研发日：技术公布日：2024/9/29