一种半重组表达合成比伐卢定的方法与流程

本发明属于多肽药物制备方法，具体地说，是关于一种半重组表达合成比伐卢定的方法。

背景技术：

1、比伐卢定于2000年和2004年先后经过美国食品药品监督管理局(fda)和欧洲药品管理局(emea)批准上市，在临床上用于经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronaryintervention pci)围术期的抗凝治疗。比伐卢定的有效抗凝成分为水蛭素衍生物片段，通过直接并特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝作用。无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合，比伐卢定均可与其催化位点和阴离子结合位点(又称底物识别位点)发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性。比伐卢定的作用方式与肝素不同，它不依赖于抗凝血酶、肝素辅因子等。凝血酶是凝血反应中起核心作用的丝氨酸蛋白酶。凝血酶可水解比伐卢定多肽顺序3#arg和4#pro之间的肽键，使比伐卢定失活，所以比伐卢定对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的。

2、比伐卢定为人工合成的二十肽，20位氨基酸残基组成的线性肽，其中1位为d型phe，其肽序结构为：h-d-phe1-pro2-arg3-pro4-gly5-gly6-gly7-gly8-asn9-gly10-asp11-phe12-glu13-glu14-ile15-pro16-glu17-glu18-tyr19-leu20-oh，化学结构式如下：

3、

4、us5196404公开了一种比伐卢定的合成方法，其采用标准boc化学固相多肽合成法，需要采用剧毒的hf作为裂解试剂，裂解时需要特殊的反应装置及操作人员防护设备，不适合规模化生产。

5、cn101094867、cn101033249和cn101555274公开的比伐卢定的合成方法均采用标准fmoc多肽固相合成法，避免了强酸切割的风险，但粗品副产物较多，纯品收率较低，三废产生量大，不利于工业化生产和环保。

6、cn101475631、cn103864895、cn102816208、cn110204611和cn105273062均采用多肽片段液相拼接的方法来合成比伐卢定，将比伐卢定分成两个、三个、四个或五个多肽片段，在液相中完成片段的拼接。该方法片段与片段间缩合效率不高，多肽片段原料及每步拼接产物都需要纯化，三废产生量大，生产成本较高，不利于环保。

7、现有的比伐卢定合成方法存在如下共有技术难点为：(1)液相合成比伐卢定工艺采用剧毒试剂，生产过程危险性较高，不适合规模化生产；(2)现有固相合成法，通过逐一偶联方式或采用片段合成法得到比伐卢定，由于多个困难点(如arg3、gly5～gly9、asn9-gly10)的存在导致粗肽纯度较低，容易产生与比伐卢定化学性质相近的杂质而造成液相纯化难度增加，产品总收率不高。

8、另外，由于比伐卢定肽序中1位为非天然氨基酸d-phe，尚未有使用基因重组表达的报导。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术所提到的问题，本发明选择一条合适的可工业化生产的合成路线，为比伐卢定的合成提供一种新的方法。

2、因此，本发明的第一个方面，提供一种半重组表达合成比伐卢定的方法，依次包括以下步骤：

3、s1：设计比伐卢定前导肽以及前体肽的串联蛋白序列，构建相应的表达质粒，转入宿主菌表达，获得比伐卢定的前体肽，该前体肽的氨基酸序列对应比伐卢定人工合成的二十肽序列的第2-20位氨基酸序列；

4、s2：使用boc-d-phe-osu对所述前体肽的1位添加一个带boc保护的非天然氨基酸d-phe，得到带boc保护的比伐卢定；

5、s3：带boc保护的比伐卢定在三氟乙酸条件下水解去boc保护，得到比伐卢定。

6、根据本发明，所述比伐卢定前导肽以及前体肽的串联蛋白序列如下：

7、前导肽-kr-(前体肽-kr)n-前体肽；

8、其中，kr为连接子，n为2-10的整数。

9、根据本发明的优选实施例，所述前导肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。

10、根据本发明，步骤s1中所述宿主菌为大肠杆菌。

11、根据本发明，步骤s1所述表达的比伐卢定前体肽还包括酶切以及分离纯化的步骤。

12、进一步的，所述酶切包括使用kex2酶和羧肽酶b进行酶切。

13、进一步的，所述比伐卢定前体肽的纯化是采用高压反相纯化系统进行纯化。

14、本发明的第二个方面，提供了一种比伐卢定前导肽以及前体肽的串联蛋白，所述串联蛋白的结构式如下：

15、前导肽-kr-(前体肽-kr)n-前体肽；

16、其中，kr为连接子，n为2-10的整数，所述前体肽的蛋白序列对应比伐卢定人工合成的二十肽序列的第2-20位氨基酸序列。

17、根据本发明的优选实施例，所述前导肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。

18、本发明的第三个方面，提供了编码所述比伐卢定前导肽以及前体肽的串联蛋白的基因，所述基因的序列如seq id no.3所示。

19、本发明具有以下有益效果：

20、解决了固相合成法得到比伐卢定粗肽纯度低，制备纯化难度较高，产品总收率不高，产生三废量大的技术问题，且无需采用剧毒试剂，生产过程中安全性更高。

技术特征：

1.一种半重组表达合成比伐卢定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s1中所述比伐卢定前导肽以及前体肽的串联蛋白序列如下：

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述前导肽的氨基酸序列如seq idno.1所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s1中所述宿主菌为大肠杆菌。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s1中所述表达的比伐卢定前体肽还包括酶切以及分离纯化的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶切包括使用kex2酶和羧肽酶b进行酶切。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述比伐卢定前体肽的纯化是采用高压反相纯化系统进行纯化。

8.一种比伐卢定前导肽以及前体肽的串联蛋白，其特征在于，所述串联蛋白的结构式如下：

9.根据权利要求8所述的串联蛋白，其特征在于，所述前导肽的氨基酸序列如seq idno.1所示。

10.编码权利要求8或9所述的串联蛋白的基因，其特征在于，所述基因的序列如seq idno.3所示。

技术总结本发明公开了一种半重组表达合成比伐卢定的方法，属于多肽药物制备方法技术领域，其主要的步骤包括：首先将带有比伐卢定前体肽串联表达基因的质粒利用基因重组技术导入到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，构建重组工程菌，经过高密度发酵并诱导后获得表达比伐卢定前体肽的串联表达蛋白，后经过溶解、过滤、酶切、纯化等步骤后得到比伐卢定前体。再经过化学合成Boc‑D‑Phe‑OSU，并与比伐卢定前体反应，得到带Boc保护的比伐卢定粗产物，最后通过水解和纯化得到比伐卢定精肽。本发明采用基因重组技术，与现有的化学合成法相比，减少了杂质的产生，纯度和收率相对较高，且不使用剧毒试剂，更安全。本发明产率高，成本低，适合大规模生产。技术研发人员：张明义,窦培冲,钟远广,张莲莲,王少佩,李慧婷,董国明受保护的技术使用者：铭诚惠众（江苏）药物研究有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/12