ω-转氨酶突变体及其在不对称合成普拉替尼药物中间体中的应用

本发明涉及生物工程，特别涉及一种ω-转氨酶突变体及其在不对称合成普拉替尼药物中间体中的应用。

背景技术：

1、转氨酶(ec 2.6.1.x，transaminase)属于吡哆醛-5’-磷酸(plp)依赖的酶家族，能够可逆地催化氨基从胺供体到胺受体的转移，在温和的反应条件下通过一步催化反应即可完成手性胺的不对称合成，理论收率高达100％，具有反应条件温和、立体选择性高、成本低以及绿色环保等优势，是手性胺工业合成领域最具应用前景的技术方法之一。

2、根据转移氨基在碳链上的位置，可将转氨酶分为α-转氨酶和ω-转氨酶。其中，α-转氨酶只转移α碳上的氨基，催化α-氨基酸与α-酮酸之间的氨基转移反应；ω-转氨酶则可以接受底物是非α-氨基酸或非α-酮酸，即ω-转氨酶有潜力催化任意结构的酮酸、酮、醛、胺。然而，野生型转氨酶由于底物结合口袋小，其天然底物主要是小分子氨基酸或酮酸等，对大型底物通常无活性或活性极低，成为制约转氨酶不对称催化合成手性胺化合物在工业应用方面的主要技术瓶颈。

3、普拉替尼(pralsetinib)是中国第一个获批上市的选择性受体酪氨酸激酶ret抑制剂，用于不可切除或转移性非小细胞肺癌和甲状腺髓样癌的靶向治疗。普拉替尼对机体耐受性好、特异性高且具有持久的抗肿瘤活性，是目前已发现药物中治疗转移性ret融合阳性非小细胞肺癌最有效的药物。普拉替尼的关键药物中间体(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺价格昂贵，其化学合成法由美国缆图药品公司开发(专利申请号：cn202010391097.9)，路线如下所示，涉及手性助剂、多种有机催化剂和溶剂、高温和超低温等复杂苛刻的反应条件，工业化难度大、成本高。

4、

5、综上，利用ω-转氨酶作为催化剂不对称合成(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺(直接催化ⅰ生成ⅱ)的应用前景非常广阔，通过分子改造提升ω-转氨酶对非天然底物的催化性能是建立ω-转氨酶催化合成该手性胺路线的重要前提。因此，需要开发高活性的ω-转氨酶催化剂，实现(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺的生物催化合成并推动绿色合成工艺的工业化应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种ω-转氨酶突变体及其在不对称合成普拉替尼药物中间体中的应用，本发明通过蛋白质工程改造提供一种对(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺的催化合成活性显著提升的ω-转氨酶突变体，以解决现有技术中化学法合成成本高、有污染以及通过ω-转氨酶催化合成时活性低的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：本发明的第一方面，提供一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其由来源于嗜热菌meiothermus granaticius的具有如seqid no.2所示的氨基酸序列的野生型ω-转氨酶通过以下任意一种突变方式得到的：第62位色氨酸突变为甘氨酸(w62g)、第62位色氨酸突变为异亮氨酸且第263位异亮氨酸突变为甘氨酸(w62i/i263g)、第62位色氨酸突变为亮氨酸且第263位异亮氨酸突变为甘氨酸(w62l/i263g)、第62位色氨酸突变为甲硫氨酸且第263位异亮氨酸突变为甘氨酸(w62m/i263g)。

3、本发明的第二方面，提供一种编码如上所述的ω-转氨酶突变体的基因。

4、优选的是，编码如上所示的野生型ω-转氨酶的核苷酸序列为seq id no.1。编码所述ω-转氨酶突变体的基因均是基于seq id no.1所示的核苷酸序列进行定点突变获得。

5、本发明的第三方面，提供一种包含如上所述的基因的重组质粒。

6、优选的是，所述重组质粒的质粒载体为pet-28a(+)或pet-22b(+)。

7、本发明的第四方面，提供一种包含如上所述的基因或是重组质粒的宿主细胞。

8、优选的是，所述宿主细胞为原核细胞。

9、优选的是，所述宿主细胞为包含如上所述的重组质粒的大肠杆菌e.coli bl21(de3)。

10、本发明的第五方面，提供一种如上所述的ω-转氨酶突变体的构建方法，该方法包括以下步骤：培养如上所述的宿主细胞，通过诱导表达所述ω-转氨酶突变体，收集宿主细胞进行破碎和离心，从上清液中分离和纯化出所述的ω-转氨酶突变体。

11、本发明还提供包含上述ω-转氨酶突变体的可溶性蛋白或工程菌。

12、本发明的第六方面，提供一种如上所述的高催化活性的ω-转氨酶突变体或宿主细胞在催化合成普拉替尼药物中间体中的应用。

13、优选的是，其应用方法为：使用如上所述ω-转氨酶突变体或宿主细胞作为生物催化剂进行酶催化反应，将胺供体的氨基转移至胺受体，通过不对称合成普拉替尼药物中间体。

14、优选的是，所述普拉替尼药物中间体为(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-甲基)吡啶-3-甲基)乙胺。

15、优选的是，所述胺供体为(s)-1-苯乙胺，酶催化反应中的添加浓度为2～20mmol/l；

16、所述胺受体为1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-酮，酶催化反应中的添加浓度为0.2～2mmol/l。

17、优选的是，进行酶催化反应的体系包括辅酶和缓冲溶液。

18、优选的是，所述辅酶为吡哆醛-5’-磷酸，酶催化反应中的添加浓度为0.1～2mmol/l；

19、所述缓冲溶液为浓度10mm的磷酸盐缓冲液。

20、优选的是，酶催化反应的温度为37℃、ph为7～10，催化反应的时间为2～12h。

21、本发明还提供上述ω-转氨酶突变体、上述基因、上述重组质粒、上述宿主细胞、上述构建方法在催化合成普拉替尼药物中间体中的应用。

22、本发明的有益效果是：

23、本发明通过定点突变和组合突变技术将来源于嗜热菌meiothermus granaticius的ω-转氨酶(seq id no.2)的第62位色氨酸和第263位异亮氨酸进行突变，获得了4种突变体(w62g、w62i/i263g、w62l/i263g和w62m/i263g)能够高效催化1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-酮不对称合成(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-甲基)吡啶-3-甲基)乙胺，37℃反应6h的转化率均高于80％，其中最高为91.37％，ee值大于99.9％，而突变之前的转氨酶野生型(wt)对该底物的转化率仅为0.07％。从上述提升效果可以看出，本发明公开的转氨酶突变体催化合成(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-甲基)吡啶-3-甲基)乙胺的转化率高、立体选择性高，具有实现(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-甲基)吡啶-3-甲基)乙胺绿色合成路线工业化的应用前景。