用于检测CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因的引物对及其应用的制作方法

本发明涉及微生物及基因检测，具体涉及一种用于检测ctx-m型超广谱β-内酰胺酶基因的引物对及其应用。

背景技术：

1、抗生素耐药已经成为了全球关注的热点。在抗生素选择压力的作用下，细菌通过表达抗生素钝化酶、改变作用靶位、改变细胞外膜通透性、主动外排、形成生物膜和交叉耐药的方式对抗药物的杀菌作用。β-内酰胺类抗生素是世界上应用最广泛的抗生素，由于其持久的选择力推动了耐药机制的多样化，导致了耐药菌株的不断增加。细菌通过产生β-内酰胺酶对抗β-内酰胺类抗生素。ambler根据蛋白质序列差异性和底物特异性将β-内酰胺酶分成a、b、c、d四类。a类(青霉素酶)、c类(头孢菌素酶)、d类(苯唑西林酶)主要通过酶活性位点的丝氨酸残基发挥药物水解作用。b类β-内酰胺酶主要通过酶活性中心的zn2+发挥水解作用，称为金属β-内酰胺酶。超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactam,esbls)属于ambler分类的a类酶，是由质粒介导的，能水解青霉素类、头孢菌素及单环酰胺类等β-内酰胺类抗菌药物的β-内酰胺酶，其对碳青霉烯类和头霉素类药物水解能力弱，可被β-内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸)所抑制。esbls主要由肠杆菌科细菌产生，以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌最为常见，主要分为tem型、shv型、ctx-m型和oxa型。在20世纪80年代和90年代，tem和shv型esbls为主流的esbl，而ctx-m的流行程度较低。21世纪初，人们观察到ctx-ms正在加速进化并呈现异常分散的传播态势，自此，ctx-ms在esbls中占主导地位，几乎取代了其他的esbls基因。这不仅归结于ctx-ms位于高度可移动的遗传平台中，还提示其储存宿主的广泛存在及高效的跨物种信息交流能力。同时，ctx-ms的产生菌对于氨基糖苷类药物和氟喹诺酮类药物的共抵抗作用可能促进了共选择的过程。在抗生素选择压力的作用及基因重组的推动下，ctx-m型超广谱β-内酰胺酶表现出显著的型别多样性，目前已有近300个基因型别。按照系统发育关系可分为7个亚群，分别为ctx-m-1，ctx-m-2，ctx-m-8，ctx-m-9，ctx-m-25，kluc，klus群。

2、临床上通常采用esbls表型筛选及确证试验先初步验证所收集菌株产超广谱β-内酰胺酶，再利用多重pcr的方法对其所产的esbls进行分型。刘朝晖等人在2006年开发了利用变性高效液相色谱快速检测ctx-m型超广谱β-内酰胺酶基因型的方法。2013年陶虹等人建立了产ctx-m和tem型esbls耐药大肠埃希菌双重pcr检测方法，旨在有效地针对动物产品中的含有这两种基因型的产esbls耐药大肠埃希菌进行特异性检测并开展相关监测工作，以将耐药大肠埃希菌食品抵御至国门之外，从而增强政府对产esbls耐药性大肠埃希菌的有效预警和防控能力，以及应对突发公共卫生事件的能力。李孟等人在2019年建立了猪源大肠杆菌对氟苯尼考、β-内酰胺类与粘杆菌素耐药基因的多重pcr检测方法，以氟苯尼考耐药基因flor、β-内酰胺耐药基因blactx-m、粘杆菌素耐药基因mcr-1作为目的基因，设计了3对特异性引物，并对多重pcr反应体系及条件进行优化。姜芹等人在2020年发明了一种用于检测产esbls大肠埃希菌中ctx-m-1群和ctx-m-9群基因的荧光定量pcr试剂盒，有助于快速检测产ctx-m型酶的大肠埃希菌。该试剂盒包括用于检测ctx-m-1群基因的上游引物、下游引物和探针，还含有用于检测ctx-m-9群基因的上游引物、下游引物和探针，含有聚合酶链式反应试剂、taq dna聚合酶。

3、目前ctx-ms基因型别数量呈爆炸性增长趋势，曾经的主流型别已经不能完全代表现状。且目前检测方法多是针对单一亚群基因型别，市场上尚未出现ctx-ms通用的扩增引物。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测ctx-m型超广谱β-内酰胺酶基因的引物对及其应用，旨在建立一种具有普适性的ctx-ms pcr检测方法，通过设计通用引物以尽全尽好的检出blactx-ms抗性基因，对了解细菌对β-内酰胺类药物的耐药情况及耐药基因分布以及指导β-内酰胺类药物临床使用及评估耐药风险具有重要意义。

2、具体的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种用于检测ctx-m型超广谱β-内酰胺酶基因的引物对，所述引物对的上游引物序列如seq id no.01所示，下游引物序列如seq id no.02所示。

4、本发明提供了一种可特异性扩增出blactx-ms序列的通用引物对，该通用引物对针对的是全基因亚群的ctx-ms型别，具有普适性和通用性。可在只使用一对引物的情况下同时检测ctx-ms基因家族中的全部型别序列，不会出现因引物过多而导致的交叉干扰问题，准确的对待测菌株所含有的blactx-ms序列情况进行鉴别检测。同时，本发明提供的通用引物对具有较好的特异性，其能准确识别出菌株中是否含有blactx-ms。

5、第二方面，本发明提供了一种用于检测ctx-m型超广谱β-内酰胺酶基因的试剂或试剂盒，其含有前面所述引物对。

6、基于前面所述引物对对ctx-ms的通用普适性及特异性，包含该引物对的试剂或试剂盒同样具有良好的通用普适性及特异性，进而能获得理想的针对ctx-ms型别的检测效果。

7、第三方面，本发明提供了所述引物对或所述试剂或试剂盒在检测ctx-m型超广谱β-内酰胺酶基因中的应用。

8、优选地，所述ctx-m型超广谱β-内酰胺酶基因包括ctx-m-1，ctx-m-2，ctx-m-8，ctx-m-9，ctx-m-25，kluc和klus亚群中的至少一种。

9、第四方面，本发明提供了检测ctx-m型超广谱β-内酰胺酶基因的方法，包括如下步骤：

10、s1、提取待测样品dna；

11、s2、以步骤s1提取到的dna为模板，使用所述引物对进行pcr扩增；

12、s3、根据步骤s2的pcr扩增结果，判断待测样品是否含有blactx-ms基因。

13、优选地，步骤s2所述pcr扩增的体系为：2×es taq mastermix12.5μl，浓度为10μmol/l的上游引物1μl，浓度为10μmol/l的下游引物1μl，水煮模板1μl，ultrapuredistilled water补足25μl。

14、优选地，步骤s2所述pcr扩增的程序为：首先，94℃预变性5分钟；然后，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，进行30个循环；最后，72℃延伸5分钟。

15、优选地，步骤s3所述判断的方法包括如下(1)、(2)和(3)中的至少一种：

16、(1)若得到的扩增片段长度为593bp，判断待测样品含有blactx-ms基因；

17、(2)若得到的扩增片段长度不为593bp，判断待测样品不含blactx-ms基因；

18、(3)若未得到扩增片段，判断待测样品不含blactx-ms基因。

19、本发明提供引物对及检测方法针对的是细菌全物种，涵盖范围广，不受物种限制。因此，在本发明中，步骤s1所述待测样品可以是各类细菌。

20、本发明提供的引物对及检测方法可应用非疾病诊断目的，如微生物的分类鉴定等。本发明提供的引物对及检测方法能为细菌中blactx-ms的快速检测提供新的检测思路，为耐药基因的分子流行病学调查提供技术手段，从而为保障食品安全、公共卫生安全和生态环境安全提供技术支撑。

21、有益效果：

22、本发明通过充分收集细菌基因组序列进行基因组注释及抗性基因比对，建立本地blactx-ms序列数据集，同时结合目前已公开发表的blactx-ms基因序列，通过分析序列结构特征，综合利用多种生物信息学工具，进行序列比对，定位保守序列区域，设计得到了针对全基因型别的特异性引物对，其上游引物序列如seq id no.01所示，下游引物序列如seq idno.02所示。将本发明提供的特异性引物对用于检测ctx-m型超广谱β-内酰胺酶基因，检测结果准确、特异性强。同时，本发明提供了一种检测ctx-m型超广谱β-内酰胺酶基因的方法，该方法操作简便快速，程序优化过程简单，可进一步结合dna测序对菌株所含的blactx-ms具体型别进行判定。本发明提供的技术方案填补了目前国内外相关领域的研究空白。