用于检测甲胎蛋白的纳米探针、金属酶联免疫吸附检测体系、试剂盒及其制备与应用的制作方法

本发明涉及医学检测，特别是涉及用于检测甲胎蛋白的纳米探针、金属酶联免疫吸附检测体系、试剂盒及其制备与应用。

背景技术：

1、众所周知，癌症对人类的健康构成严重威胁。肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是全球发病率和致死率最高的肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下，对人类造成了极大的危害。目前，肝脏对比增强ct(computed tomography)和mr(magneticresonance)成像是临床筛查和诊断hcc的重要手段，除此之外，肿瘤生物标志物在癌症筛查中也发挥着重要作用。在这些生物标志物中，甲胎蛋白(alpha fetoprotein,afp)在hcc患者的血浆中浓度升高，是准确诊断和有效监测hcc的重要而可靠的生物标志物。健康人的afp含量通常低于10ng ml-1，而hcc患者的afp含量相较健康群体则高得多。因此，早期检测afp至关重要，因为它能有效预防、降低hcc死亡率并延长患者的预期寿命。

2、在过去几十年中，已有多种技术用于afp检测，如荧光法、光电化学传感器、等离子体酶联免疫吸附法和电位免疫测定法。这些技术需要精密的仪器、对操作人员有较高的要求，因此不适用于一般的临床检测实验室。酶联免疫吸附试验(enzyme linkedimmunosorbent assay,elisa)是临床上应用最广泛的afp检测技术，其检测成本低、操作简便且不需要昂贵的设备。此外，它有效地利用了抗原抗体的高特异性结合反应和酶的高效催化特性，确保了该检测的灵敏度和特异性。尽管酶在这一平台中发挥着重要作用，但与一般化学产品相比，酶往往存在稳定性差、灵敏度有限、对温度和ph的耐受性较低等问题。因此，需要开发一种更稳定、更简便、更灵敏的afp检测技术，以更好地满足临床诊断和治疗的需求。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于检测甲胎蛋白的纳米探针、金属酶联免疫吸附检测体系、试剂盒及其制备与应用，为afp的检测提供一种更稳定、更简便、更灵敏的afp的技术。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种纳米探针(cu-mofs@auptnps-ab)，包括金属酶，以及与所述金属酶连接的抗甲胎蛋白抗体；所述金属酶为cu-mofs@auptnps复合纳米材料，所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料包括铜金属有机框架(cu-mofs)和均匀粘附在所述铜金属有机框架(cu-mofs)表面上的金铂纳米颗粒(auptnps)。

3、进一步，所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料具有类辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,hrp)特性。

4、进一步，所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料通过au-ah2和/或au-s化学键连接所述抗甲胎蛋白抗体。

5、进一步，所述金铂纳米颗粒(auptnps)为核壳结构纳米复合材料，包括核心金纳米颗粒(aunps)，以及均匀负载在所述核心表面上的铂纳米颗粒(ptnps)；优选地，所述金铂纳米颗粒(auptnps)的核心直径为20～40nm，壳层厚度为8～12nm。其中，所述壳层由所述铂纳米颗粒(ptnps)均匀负载在所述核心表面上形成。

6、进一步，所述铜金属有机框架(cu-mofs)包括铜离子和对苯二甲酸根离子。

7、进一步，所述铜金属有机框架(cu-mofs)呈二维片状结构。

8、进一步，所述铜金属有机框架(cu-mofs)的平均尺寸为180～220nm。

9、进一步，所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料的平均水合粒径为130～160nm。

10、进一步，所述纳米探针的平均水合粒径150～200nm。

11、本发明第二方面提供一种根据第一方面所述的纳米探针的制备方法，包括：通过静电吸附反应，将所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料标记在所述抗甲胎蛋白抗体上，形成所述纳米探针。

12、进一步，通过静电吸附反应，将所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料标记在所述抗甲胎蛋白抗体上，形成所述纳米探针，包括：

13、将所述抗甲胎蛋白抗体加入所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料的分散液中，搅拌进行静电吸附反应，形成所述纳米探针。

14、进一步，静电吸附反应温度为0～8℃。

15、进一步，静电吸附反应时间≥6小时，优选为6～24小时。

16、进一步，所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料的分散液由所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料分散在缓冲液制备而成。

17、进一步，静电吸附反应结束后，对反应液进行多次离心处理，获得所述纳米探针。多次离心处理是为了去除多余的抗体和cu-mofs@auptnps复合纳米材料。

18、进一步，所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料的合成方法包括：将所述金铂纳米颗粒(auptnps)原位合成在所述铜金属有机框架(cu-mofs)上，形成所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料。

19、进一步，所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料的合成方法包括：以所述铜金属有机框架(cu-mofs)、金源、铂源为原料，在还原剂作用下，通过一锅法经水热反应制备得到所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料。

20、进一步，所述水热反应包括第一步水热反应和第二步水热反应，所述第一步水热反应包括形成金纳米颗粒(aunps)以及使金纳米颗粒(aunps)负载在所述铜金属有机框架(cu-mofs)上的过程，所述第二步水热反应包括形成铂纳米颗粒(ptnps)，铂纳米颗粒(ptnps)均匀负载在金纳米颗粒(aunps)表面形成核壳结构的金铂纳米颗粒(auptnps)，并最终获得所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料的过程。

21、进一步，所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料的合成方法包括如下步骤：

22、s1、将金源溶液逐滴滴加入所述铜金属有机框架(cu-mofs)的分散液中，搅拌加热至沸腾后，加入还原剂，继续搅拌直至溶液呈现酒红色；

23、s2、将酒红色溶液冷却至室温后，加入水，搅拌加热至沸腾后，依次加入铂源溶液和还原剂，继续搅拌反应；反应结束后冷却至室温，洗涤、离心和干燥，得到所述cu-mofs@auptnps复合纳米材料。

24、进一步，所述金源选自氯金酸、三氯化金、氯金酸钠、氯金酸钾、氯金酸铵、硝酸金、醋酸金中的至少一种。

25、进一步，所述铂源选自氯铂酸、氢氯铂酸、氯亚铂酸、氯铂酸钠、氯铂酸钾、氯铂酸铵、四氯化铂、硝酸铂、硫酸铂中的至少一种。

26、进一步，所述还原剂选自柠檬酸钠、抗坏血酸、硼氢化钠中的至少一种。

27、进一步，所述铜金属有机框架(cu-mofs)、金源与铂源的质量比为10～30:1～5:30～100。

28、进一步，所述步骤s1中，还原剂加入后，继续搅拌10～20分钟，直至溶液呈现酒红色。

29、进一步，所述步骤s2中，还原剂加入后，继续搅拌反应20～40分钟。

30、进一步，所述铜金属有机框架(cu-mofs)的合成方法包括：以铜源和有机配体为原料，通过溶剂热合成法制备得到所述铜金属有机框架(cu-mofs)。

31、进一步，通过溶剂热合成法制备得到所述铜金属有机框架(cu-mofs)的反应时间为12～36小时。

32、进一步，所述铜源与有机配体的摩尔比为1:1～5。

33、进一步，所述铜源选自醋酸铜、氯化铜、硝酸铜、硫酸铜中的至少一种。

34、进一步，所述有机配体选自对苯二甲酸、均苯三甲酸、2氨基对苯二甲酸、2硝基对苯二甲酸、2羟基对苯二甲酸、均苯三甲酸、2甲基咪唑、三乙酰基苯中的至少一种。

35、进一步，所述溶剂包括n,n二甲基甲酰胺和乙腈，优选地，所述溶剂为体积比为1～2:1的n,n-二甲基甲酰胺和乙腈混合物。

36、本发明第三方面提供一种检测体系，包括如第一方面所述的纳米探针和/或根据第二方面所述的方法制备得到的纳米探针，还包括能特异性结合甲胎蛋白抗原的捕获抗体，以及用于酶联免疫吸附试验的显色液和终止液；所述检测体系通过金属酶联免疫吸附试验检测甲胎蛋白。

37、进一步，所述捕获抗体选自所述抗甲胎蛋白抗体。

38、进一步，所述显色液包括氧化剂和显色剂，所述氧化剂为过氧化氢(h2o2)，所述显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,tmb)。

39、进一步，所述终止液为硫酸，优选为0.5m～2m硫酸。

40、进一步，所述检测体系还包括牛血清白蛋白(bsa)。

41、本发明第四方面提供如第一方面所述的纳米探针和/或根据第二方面所述的方法制备得到的纳米探针和/或如第三方面所述的检测体系在制备甲胎蛋白检测试剂中的应用。

42、本发明第五方面提供一种金属酶联免疫吸附试剂盒，包括如第一方面所述的纳米探针和/或根据第二方面所述的方法制备得到的纳米探针和/或如第三方面所述的检测体系。

43、如上所述，本发明的用于检测甲胎蛋白的纳米探针、金属酶联免疫吸附检测体系、试剂盒及其制备与应用，具有以下有益效果：

44、本发明基于自主合成的cu-mofs@auptnps纳米复合材料标记afp抗体构建了一种新型纳米探针，并以该纳米探针作为信号探针建立了一种新型的金属酶联免疫吸附测定(melisa)检测体系，再进一步开发成相关的melisa试剂盒，以用于血清中afp的超灵敏、特异性检测，实现可视化阅读结果，在临床诊断中具有巨大的应用潜力。

45、本发明提供的纳米探针中cu-mofs@auptnps纳米复合材料是作为类hrp以用于信号放大，其优点如下：首先，与hrp相比，cu-mofs@auptnps具有更好的稳定性和重复性，并且不易受温度和ph值的干扰。其次，这种新型纳米材料可以通过au-ah2或au-s化学键连接各种生物大分子。最后，与cu-mofs或auptnps相比，cu-mofs@auptnps复合纳米材料具有更优越的催化性能。这些优异性能使cu-mofs@auptnps纳米复合材料在比色法中独具特色，与hrp相比具有极大的优势。

46、本发明提供的检测体系包含能特异性结合afp抗原的捕获抗体，利用抗原抗体结合的特异性，保证了melisa的检测特异性；同时，加入牛血清白蛋白(bsa)即可阻断非特异性结合，通过双抗夹心的应用进一步提高了反应的特异性。

47、与传统的检测方法相比，本发明提供的melisa检测手段具有以下优势：

48、1、通过肉眼和微孔板阅读器都能读取结果，更加方便简单；

49、2、对设备要求较低，实验条件兼容性高；

50、3、检测性能优异：48例临床样本结果与金标准方法检测结果灵敏度完全一致，能满足临床对afp初筛需求；

51、4、检测限更低，灵敏度更高，对患者样本需求量少；

52、5、操作方式简单，对操作人员技术要求低；

53、6、检测成本低，大约15元/人份。

54、7、可在资源匮乏地区或者需要进行即时检验的场景开展afp检测。

55、综上，本发明结合了新型纳米复合材料类hrp活性、抗原抗体结合的特异性和可视化阅读结果的优点，开发了一种新型的melisa检测手段，为临床样本中afp的超灵敏检测提供了一个特异性和灵敏度极高、临床适用性好、可操作性强、检测成本低的床旁检测平台，非常适合应用于资源匮乏地区或者需要进行即时检验的场景，在实现精准医疗方面具有重要的实用价值。