一种两亲性树枝状多肽分子及其合成方法、自组装方法

本发明涉及生物医药，具体涉及一种两亲性树枝状多肽分子及其合成方法、自组装方法。

背景技术：

1、树枝状大分子是由低聚物通过枝化单元重复、线性连接而成的大分子，通常由内核、聚合物主链和树枝单元的侧链组成，是一种具有高度枝化结构的单分散聚合物。其内部含有空腔、表面富有活性官能团、理化性质可控的特点使之广泛应用于生物医学领域(如药物递送、疾病诊断和治疗等)。

2、发展较早且应用较多的物质主要有聚酰胺-胺，聚丙烯亚胺(ppi)、聚l-赖氨酸(pll)等，这些树枝状大分子中含有的大量氨基和酰胺基团使其具有良好的水溶性。内部广阔的空腔结构使其广泛用于递送难溶性小分子药物，可发挥增溶与延长药物半衰期的作用。通常与活性官能团共价结合，或者与阳离子表面静电结合用于外部载药，在基因转染和诊疗成像等方面都展现出良好的效果。

3、然而，树枝状分子不仅存在合成步骤繁多、容易形成结构缺陷等问题，导致质量控制困难，而且在生物可降解性和生物安全性方面性能欠佳，对其临床应用造成了阻碍。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种两亲性树枝状多肽分子及其合成方法、自组装方法。

2、为实现上述发明目的，第一方面本发明提供了一种两亲性树枝状多肽分子，由亲水性的树枝状部分、疏水部分以及中间的连接单元构成，其结构式为：

3、

4、式中，r51-r5n为亲水性的树枝状部分，r1为疏水部分，r2-r4为中间的连接单元。

5、在一个实施例中，所述亲水性的树枝状部分由极性可迭代的氨基酸单元或者结构单元a构成，所述氨基酸单元包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬氨酸中的至少一种，所述结构单元a为5-氨基-2-(3-氨基丙基)戊酸，其结构式为：

6、

7、在一个实施例中，所述疏水部分包括碳链长度介于6至20个碳原子之间的饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇或聚合度大于三的疏水肽段；所述疏水部分为单链或者双链。

8、在一个实施例中，所述中间的连接单元r2包括结构单元a，r3包括aeea基团，r4包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬氨酸中的至少一种，所述aeea基团的结构式为：

9、

10、第二方面，本发明提供了一种两亲性树枝状多肽分子的合成方法，包括：

11、步骤一、使用3倍于反应容器中树脂体积的dcm溶剂浸泡树脂并溶胀5min，完成后过滤排除dcm溶剂；从步骤一到步骤七的反应过程需要通n2鼓泡搅拌；

12、步骤二、对经过步骤一溶胀后的树脂进行脱保护处理，用体积浓度为20％的哌啶dmf溶液反应5-10min，反应结束后用dmf洗涤5次；

13、步骤三、将3当量的fmoc-lys(mtt)-oh通过脱水缩合反应偶联至步骤二中树脂脱保护后暴露出的活性基团氨基上，缩合剂tbtu和diea为3当量，溶剂为dmf，反应1h，反应结束后用dmf洗涤5次；

14、步骤四、用体积浓度5％-10％的三氟乙酸二氯甲烷溶液脱掉步骤三中赖氨酸的mtt保护基，反应15min，此过程重复2次，结束后用dcm和dmf各洗涤3次；

15、步骤五：将十八烷酸通过脱水缩合反应偶联至步骤四中赖氨酸暴露出的氨基上，偶联方法同步骤三中所述；

16、步骤六、利用步骤二中的方法脱除步骤四中赖氨酸的fmoc保护基，然后用步骤三中的方法偶联新的fmoc-lys(fmoc)-oh结构单元，重复此步骤至需要的树枝状结构代数，末端赖氨酸以boc-lys(boc)-oh为结构单元进行偶联；其中，脱保护反应的次数与需要脱保护的fmoc基团数目相同；当同时偶联2个结构单元时，原料和缩合剂为5当量，缩合剂为tbtu和diea；当同时偶联4个结构单元时，原料和缩合剂用5当量，并偶联2次，第一次选用缩合剂tbtu和diea，第二次选用oxyma和dic；

17、步骤七、当末端赖氨酸偶联完成后，用dcm和dmf各洗涤3次，再用甲醇收缩树脂并烘干；

18、步骤八、用裂解液将末端赖氨酸的boc保护基和连接产物的树脂载体同时脱除，此时从树脂上切下来的产物溶解到上述裂解液中，形成产物溶液；反应时间为2h，切肽过程需要磁力搅拌，1g树脂需要10-15ml裂解液；

19、步骤九、将产物溶液滴至弱极性的溶剂里，体积比为1:5，此时产物析出，通过离心操作沉底，并用醚类纯溶剂清洗3遍除去杂质，干燥后得到粗品；

20、步骤十、用半制备液相色谱和反相c18色谱柱对粗品进行过柱分离后得到最终产物。

21、在一个实施例中，其分子的结构式为：

22、

23、第三方面，本发明提供了一种两亲性树枝状多肽分子的合成方法，包括：

24、步骤一、使用3倍于反应容器中树脂体积的dcm溶剂浸泡树脂并溶胀5min，完成后过滤排除dcm溶剂；从步骤一到步骤十的反应过程需要通n2鼓泡搅拌；

25、步骤二、对经过步骤一溶胀后的树脂进行脱保护处理，用体积浓度为20％的哌啶dmf溶液反应5-10min，反应结束后用dmf洗涤5次；

26、步骤三、将3当量的dde-lys(fmoc)-oh通过脱水缩合反应偶联至步骤二中树脂脱保护后暴露出的活性基团氨基上，缩合剂tbtu和diea为3当量，溶剂为dmf，反应1h，反应结束后用dmf洗涤5次；

27、步骤四、用步骤二中的方法脱除步骤三中赖氨酸的fmoc保护基，用步骤三中的方法将fmoc-aeea-oh偶联至其暴露出的氨基上；

28、步骤五、用步骤二中的的方法脱除步骤四中fmoc-aeea-oh的fmoc基团，然后用步骤三中的方法将带有fmoc保护基的结构单元a偶联至aeea的氨基上；

29、步骤六、用步骤二中的方法脱除结构单元a上的fmoc保护基，脱保护反应进行2次，再用步骤三中的方法将两个十八烷酸与结构单元a的两个氨基相连，十八烷酸和缩合剂为5当量；

30、步骤七、通过含有5％水合肼的dmf溶液反应10min脱掉步骤三中赖氨酸上的dde保护基，用dmf洗涤5次，然后用步骤三中的方法偶联带有fmoc保护基的结构单元a；

31、步骤八、用步骤二中的方法脱除结构单元a的fmoc保护基，脱保护反应进行2次，然后用步骤三中的方法偶联新的带有fmoc保护基的结构单元a，原料和缩合剂用5当量；

32、步骤九、用步骤二中的方法脱除结构单元a的fmoc保护基，脱保护反应进行4次，末端赖氨酸以boc-lys(boc)-oh为原料偶联，原料和缩合剂用5当量，偶联2次，第一次选用缩合剂tbtu和diea，第二次选用oxyma和dic；

33、步骤十、步骤九偶联反应完成后，用dcm和dmf各洗涤3次，再用甲醇收缩树脂并烘干；

34、步骤十一、用裂解液将末端赖氨酸的boc保护基和连接产物的树脂载体同时脱除，此时从树脂上切下来的产物溶解到上述裂解液中，形成产物溶液；其中，反应时间为2h，切肽过程需要磁力搅拌，1g树脂需要10-15ml裂解液；

35、步骤十二、将产物溶液滴至弱极性的溶剂里，体积比为1:5，此时产物析出，通过离心操作沉底，并用醚类纯溶剂清洗3遍除去杂质，干燥后得到粗品；

36、步骤十三、用半制备液相色谱和反相c18色谱柱对粗品进行过柱分离后得到最终产物。

37、在一个实施例中，其分子的结构式为：

38、

39、第四方面，本发明提供了一种两亲性树枝状多肽分子的自组装方法，包括：

40、将一定量的所述两亲性树枝状多肽分子称入梨形瓶中，加入易挥发溶剂对其进行溶解；

41、溶解后在旋蒸瓶进行旋蒸操作，使所述两亲性树枝状多肽分子在瓶壁上均匀成膜，后采用n2吹扫，挥干所述易挥发溶剂；

42、向旋蒸瓶中加入一定量的水化液并不断晃动，使瓶壁上的膜层进行充分水化，充分水化后进行水浴超声，水浴超声后，等待胶束形成，至此完成两亲性树枝状多肽分子的自组装工作。

43、在一个实施例中，所述易挥发溶剂包括乙醇、甲醇或丙酮中的至少一种；所述水化液包括pbs缓冲液、hepes缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、纯水中的至少一种。

44、本发明相对于现有技术的优点以及有益效果为：

45、1、树枝状大分子不仅合成复杂容易出现结构缺陷，而且生物可降解性和生物安全性欠佳。本发明主要是通过两亲性树枝状多肽分子的自组装过程，使其具有树枝状大分子相似的结构和功能，并且具有合成更简便、结构更可控、生物可降解性和生物安全性更高的优势。

46、2、本发明提出了一类新型的两亲性树枝状多肽分子和一种自组装的方法。该分子主要以氨基酸为树枝状部分的结构单元，以脂肪酸为疏水的尾部，并以多官能度氨基酸为中间连接单元。经验证，这种两亲性树枝状多肽分子具有良好的自组装特性，改变组装条件即可调控该分子的结构。除保留树枝状大分子的结构特性，其具有合成更简便、产物纯度高、自组装体结构调整更灵活以及更高的生物安全性和生物可降解性的优势，具有良好的生物医学应用前景。

47、3、本发明涉及的结构式可以在树脂载体上一步进行合成，而不用将亲水性部分和疏水性部分分别合成再进行对接，提高了合成效率。