重组核酸切刻酶及其制备方法与流程

本发明属于酶制备方法，具体地，涉及一种重组核酸切刻酶vvn的制备方法。

背景技术：

1、下一代测序技术(ngs)，又称作高通量测序技术，通常用于基因组学、转录组学、表观遗传学等领域的研究。主要的实验操作包括：基因片段化、建库、测序仪测序、生信分析等。建库前需将dna进行打断，目前主要有机械法和酶切法两种方法。机械法会对dna造成明显的损伤，且超声仪器与耗材成本居高不下，通量低，稳定性不好。而片段化酶与常规建库试剂搭配的酶切法建库试剂盒是比较好的方法，其中fragmentase酶则是大众所熟知的片段化酶。

2、fragmentase酶是由切刻酶vvn和t7核酸内切酶i这两种酶按照比例混合而成。工作原理是：切刻酶vvn随机地在dna双链上产生切刻，切刻处经t7核酸内切酶i识别，对双链dna进行打断，打断后的dna有很短的突出末端，5’含有磷酸基团，3’端含有羟基，从而实现dna的片段化。

3、切刻酶vvn来源于创伤弧菌(vibrio vulnificus)，分子量大小是25kda，具有切刻功能，表达易于形成包涵体。包涵体难以复性，酶活受到限制，所以切刻酶vvn的可溶性表达与纯化是个难题，这很大地制约了在工业生产上的应用。

技术实现思路

1、鉴于目前核酸切刻酶vvn表达与纯化困难、价格昂贵等问题，本发明通过改造核酸切刻酶vvn的质粒(在n端加入不同的促溶标签，c端含有his标签)、选择纯化方法(镍柱加肝素柱)等策略使得vvn的制备易于生产、降低成本、适合工业生产。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、重组核酸切刻酶vvn，所述切刻酶vvn的n端添加mbp促溶标签，c端含有his标签，其制备方法如下：

4、(1)将密码子优化的核酸切刻酶vvn基因(seq id no.1所示)和mbp促溶标签共同克隆到pet28a载体中，得到重组表达质粒pet28a-mbp-vvn；

5、(2)重组表达质粒pet28a-mbp-vvn转化大肠杆菌中诱导表达；

6、(3)使用破胞仪破碎菌体，收集上清液，将上清液通过镍柱纯化，得到初步纯化的重组核酸切刻酶vvn溶液；

7、(4)将初步纯化的重组核酸切刻酶vvn溶液通过肝素柱纯化，收集纯化的重组核酸切刻酶vvn再使用蛋白保存液透析过夜；

8、优选地，所述步骤(3)中使用含有100mm和150mm咪唑的溶液梯度洗去杂蛋白，再使用含有250mm或350mm咪唑的缓冲液洗脱蛋白。

9、优选地，所述步骤(4)中使用5％ b液冲洗肝素柱，100％b液线性梯度洗脱蛋白30min，所述b液包括50mm tris、5％甘油、0.1mm edta、1mm dtt、1m nacl，ph＝6.5。

10、本发明还保护核酸切刻酶vvn在dna建库中的应用。

11、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

12、本发明基于核酸切刻酶vvn性质，对核酸切刻酶vvn的质粒加入促溶标签，选择适合的宿主细胞、蛋白纯化方法(镍柱加肝素柱)，使得核酸切刻酶vvn的制备易于生产、降低成本、适合工业生产，且酶活较高。

技术特征：

1.重组核酸切刻酶vvn，其特征在于，所述切刻酶vvn的n端添加mbp促溶标签，c端含有his标签。

2.重组核酸切刻酶vvn的制备方法，其特征在于，包括以下方法：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述密码子优化的核酸切刻酶vvn基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中使用含有100 mm和150mm咪唑的溶液梯度洗去杂蛋白，再使用含有250 mm或350 mm咪唑的缓冲液洗脱蛋白。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中使用5% b液冲洗肝素柱，100%b液线性洗脱蛋白30 min，所述b液包括50 mm tris 、5%甘油、0.1 mm edta、1 mmdtt、1m nacl，ph=6.5。

6.权利要求1所述的重组核酸切刻酶vvn在dna建库中的应用。

技术总结本发明公开了重组核酸切刻酶及其制备方法，在核酸切刻酶Vvn的N端加入MBP促溶标签促进Vvn可溶性表达，Vvn的C端含有His标签改进纯化方式，提升蛋白的可溶性表达和纯度。本发明所述的制备方法易于等比放大提高产量，在生产高纯度、价格较低、稳定保存方面具有很好的应用价值。技术研发人员：付亮亮,李新云,谢东芳,涂思梅受保护的技术使用者：武汉影子基因科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/12