一种新型冠状病毒重组亚单位抗原及其制备方法和应用

本发明属于生物制药，具体涉及一种新型冠状病毒重组亚单位抗原及其制备方法和应用。

背景技术：

1、新型冠状病毒疫苗作为有效的防控途径，各种类型的新冠疫苗如灭活疫苗、mrna疫苗、重组蛋白疫苗获得批准使用。但是，一方面由于新冠变异速度快使得疫苗对不同变异株的保护效果下降，另外一方面由于接种疫苗的体液免疫保护作用时间较短，使得目前针对新冠仍然未能找到有效的控制办法。

2、有研究表明在covid-19和sars以及未感染对照病例中均检测到了sars-cov-2特异性t细胞免疫，这说明β冠状病毒感染诱导的病毒特异性t细胞不仅可以持续长达17年，也具有交叉反应性，提示t细胞免疫为恢复和长期保护的重要决定因素。更重要的是，显著病毒特异性t细胞反应与症状的存在或轻重无关，且对于一些体液免疫缺陷的患者存在特异性t细胞保护作用。这些研究均表明t细胞免疫反应在对sars-cov-2感染后机体的长效记忆保护中发挥至关重要的作用。

3、随着对sars-cov-2t细胞表位的研究，已完成针对新冠的全基因组的蛋白表位谱的高通量分析。刺突的rbd的关键位点的突变使得靶向rbd的疫苗和中和抗体效果显著下降，且交叉中和活性较弱，限制作为预防或治疗高致病性新hcov感染的能力。与sars-cov-2rbd区域大量突变相比，s2融合亚基在不同变异株之间保持高度保守，特别是在细胞融合发挥重要作用的fp、hr1和hr2等区域。目前已有多篇文献报道靶向融合肽(fp)、七联体重复序列1和2(hr1-hr2)束、茎螺旋(sh)，以及相关的s2抗病毒多肽药物。这些抗病毒多肽药物对多种冠状病毒均有抑制细胞融合等效果，进而可以广泛且有效地抑制sars-cov-2及其变种以及其他人类冠状病毒的感染。

4、为了应对sars-cov-2病毒的不断变异，研发更加安全有效的sars-cov-2疫苗是目前较为紧迫的问题。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种新型冠状病毒重组亚单位抗原。

2、具体来说，本发明具有以下技术方案：

3、一方面，本发明提供新型冠状病毒重组亚单位抗原，其氨基酸序列如seq id no：1所示或与seq id no：1所示序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)。

4、另一方面，本发明提供分离的多核苷酸，其编码如上所述的新型冠状病毒重组亚单位抗原。任选地，所述多核苷酸的序列如seq id no：2所示。

5、另一方面，本发明提供载体，其包含如上所述的多核苷酸，任选地，所述载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体和痘病毒载体。

6、另一方面，本发明提供重组蛋白，其包含如上所述的新型冠状病毒重组亚单位抗原。

7、另一方面，本发明提供宿主细胞，其包含如上所述的多核苷酸或如上所述的载体，任选地，所述宿主细胞选自来自个体的任何原代细胞，优选hek293t细胞。

8、另一方面，本发明提供疫苗组合物或试剂盒或免疫原性组合物，其包含如上所述的新型冠状病毒重组亚单位抗原或如上所述的多核苷酸或如上所述的载体，和药学上可接受的载体和/或辅料。

9、另一方面，本发明提供抗体或抗原结合片段，其由如上所述的新型冠状病毒重组亚单位抗原制备而成。

10、另一方面，本发明提供药物组合物，其包含如上所述的抗体或抗原结合片段，和药学上可接受的载体和/或辅料。

11、另一方面，本发明提供如上所述的新型冠状病毒重组亚单位抗原或如上所述的多核苷酸或如上所述的载体或如上所述的重组蛋白或如上所述的宿主细胞在制备新型冠状病毒疫苗或抗体或检测试剂中的用途。

12、另一方面，本发明提供刺激、引发t细胞免疫反应和/或b细胞免疫反应的(优选体外)方法，其包括施用有效量的如上所述的新型冠状病毒重组亚单位抗原或如上所述的多核苷酸或如上所述的载体或如上所述的重组蛋白或如上所述的宿主细胞，所述方法用于非诊断或治疗目的。

13、另一方面，本发明提供如上所述的抗原的制备方法，包括以下步骤：

14、步骤1.将hr1-vv-hr2-vs的核苷酸序列作为目的基因与ptt5质粒进行克隆构建，获得质粒；所述hr1-vv-hr2-vs的核苷酸序列如seq id no:2所示；

15、步骤2.构建好的克隆质粒经pei转染至hek293f细胞中，层析纯化细胞上清即得到所需新型冠状病毒重组蛋白。

16、优选的，所述步骤1中，将目的基因插入到ptt5质粒的酶切位点sal i和xba i之间，方法为：将目的基因pcr回收产物和ptt5线性质粒pcr回收产物按物质的量之比4:1混匀，加入gibson组装酶，50℃水浴条件下孵育15min。

17、优选的，所述步骤2中，用聚乙烯亚胺(pei)将构建载体转染到hek293f细胞中(密度约2.5×106细胞/ml)，在freestyletm293表达培养基(购于永联生物)对转染后的哺乳动物细胞在5％ co2，150rpm/min，37℃下培养4天，然后通过3000rpm/min离心10分钟收集细胞培养上清液。用蛋白a柱纯化目的蛋白-fc融合蛋白，采用0.1m乙酸洗脱，对洗脱下的蛋白进行tev酶切后用蛋白a柱纯化切开的fc和ni柱纯化加入的tev酶后收集流穿液。对收集的流穿蛋白进行凝胶过滤层析后进行sds-page电泳分析并浓缩。

18、定义

19、t细胞免疫反应：t细胞免疫主要是由cd4+t细胞和cd8+t细胞引发的免疫。病毒特异性cd4+t细胞可分化为th1细胞和t滤泡辅助细胞(tfh)，前者产生ifn-γ和相关细胞因子发挥抗病毒效应，后者在高亲和的抗体的产生和记忆b细胞分化发挥重要作用。特异性cd8+t细胞高表达ifn-γ、颗粒酶b、穿孔素和cd107a等细胞毒性效应功能分子，对杀死受感染的细胞至关重要。

20、tfh细胞：其主要功能是参与b细胞分化过程中的信息传递，协助激活b细胞，促进生发中心的形成和免疫球蛋白的类别转换，维持长时间体液免疫应答。

21、ox40：也称为cd134，是一种细胞表面蛋白。它主要表达在活化的t细胞、某些b细胞和其他免疫细胞的表面。ox40通常作为一种共刺激分子，参与调节t细胞的活化和功能。

22、4-1bb：在多种细胞中表达，包括活化的t细胞。

23、cd69：是t细胞活化的一个标志物，属于t细胞活化之后发生上调的最早标志物之一。

24、gl7：只在活化b细胞表达，不在幼稚b细胞表达。

25、cxcr5：主要表达在成熟的b细胞及滤泡辅助t细胞中。

26、gc：生发中心，位于次级淋巴组织，是淋巴细胞与基质细胞的短暂聚集地，促进体液免疫过程。在生发中心中，b细胞经历了克隆扩增、体细胞高频突变、亲和力选择以及分化为浆细胞和记忆b细胞等过程。

27、有益效果

28、本发明提供的新型冠状病毒重组蛋白针对冠状病毒以及新冠突变株具有高度的保守性，并含有丰富的有效t细胞表位，免疫原性好，可刺激机体产生抗原特异性的抗体和细胞免疫反应。

29、本发明的重组蛋白可利用真核表达系统作为表达载体，具有产量高、蛋白纯度高且状态同生理状态类似等优点，适用于大规模制备新冠疫苗。