一种基于微流控的大孔细胞培养微载体的制备方法与流程

本发明涉及生物材料，具体涉及一种基于微流控的大孔细胞培养微载体的制备方法。

背景技术：

1、随着医疗、生物行业的发展，许多细胞诸如人源性干细胞、胰岛β细胞等的大规模培养受到了人们广泛的关注。三维细胞培养比起传统的二维细胞培养能够为细胞提供更多的生长空间，能够模拟微环境给细胞提供氧气、营养物质等，提高了细胞的培养效率。在这样的培养环境中，大孔微载体比实心微载体的比表面积大，能为细胞提供更多的生长空间，且细胞在孔内生长，能减小剪切力对细胞的损伤。

2、大孔微载体的制备方法有在微流体装置中利用甲基丙烯酰胺基明胶光固化后干燥形成尺寸均一、生物相容性好的微球(cn115804758a)；也有通过牺牲模板法，固化后得到多孔水凝胶微球结构(cn113755425a)。现有技术路线中单纯依靠水凝胶干燥形成的大孔结构存在一定的随机性，而牺牲模板法大多依赖于界面能形成内腔，在固化之前并不稳定，且需要三相互相剪切工艺复杂。因此，亟需提供一种基于微流控的大孔细胞培养微载体的制备方法来解决现有技术中的缺陷。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足，本发明提供一种新的制备大孔微载体的方法，本方法提供一种简便的牺牲模板法，所制备的大孔微载体粒径均匀、内腔稳定可调节。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、一种基于微流控的大孔细胞培养微载体的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤一，微流控液滴模板微球的制备：以主体材料及模板微球的混合液作为内相，油相作为外相；通过调节内、外相溶液的流速，形成油包水的液滴模板微球；

5、步骤二，主体材料的固化：将步骤一制备得到的液滴模板微球在紫外光下照射，聚合内相溶液；或者是，将步骤一制备得到的液滴模板微球放入固化液中，获得稳定的大孔微载体产物；步骤三，模板微球的去除：将步骤二制备得到的产物干燥后，放入溶液中去除模板微球；或者是，将步骤二制备得到的产物放入溶液中去除模板微球后进行干燥，得到所述的大孔细胞培养微载体。

6、本发明涉及的细胞培养大孔微载体包括主体材料层和微球内腔：以微球作为牺牲模板，混入主体材料层，基于微流控技术制备粒径均一的液滴，待主体材料固化后，去除牺牲模板，以制备粒径均一、内腔数量及大小可调节的大孔微载体。

7、本发明所述制备方法由三个步骤组成；

8、步骤一，微流控液滴模板微球的制备：以主体材料及模板微球的混合液作为内相，油相作为外相；通过调节内、外相溶液的流速，利用液体的剪切力形成油包水的液滴模板微球；具体的同时向装置内通入内相溶液和外相溶液，调节溶液流速，使得外相溶液在内相毛细管尖端产生剪切力，促使内相溶液成为液滴微球，后液滴微球通过收集管离开装置。

9、所述主体材料包括但不限于胶原、壳聚糖、海藻酸盐、琼脂糖、聚甲基丙烯酸羟乙酯、微晶纤维素、聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯酰明胶、丙烯酰胺、n-异丙基丙烯酰胺中的一种或多种；所述模板微球包括但不限于聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、三聚氰胺微球中的一种或多种；所述油相包括但不限于液体石蜡、硅油、矿物油、氟化油、棕榈油中的一种或多种；

10、步骤二，主体材料的固化：将步骤一制备得到的液滴模板微球在紫外光下照射，聚合内相溶液；或者是，将步骤一制备得到的液滴模板微球放入固化液中，获得稳定的大孔微载体架构；内相溶液聚合是主体材料聚合，模板微球的优势是稳定，不参与聚合反应。

11、所述固化液包括但不限于戊二醛、乙醇、钙离子溶液、碱液、酸液中的一种或多种；所述钙离子溶液为水溶液，包括但不限于氯化钙、硝酸钙、磷酸钙、硫酸钙中的一种或多种，碱液包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钠中的一种或多种；酸液包括但不限于甲酸、乙酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸中的一种或多种。

12、步骤三，模板微球的去除：将步骤二制备得到的产物干燥后，放入溶液中去除模板微球；或者是，将步骤二制备得到的产物放入溶液中去除模板微球后进行干燥；

13、所述溶液包括但不限于甲苯、二氯甲烷、丙酮、n,n-二甲基甲酰胺、氢氟酸、乙酸、甲酸、盐酸、磷酸、碱液中的一种或多种。

14、步骤一，微流控液滴模板微球的制备：以主体材料及模板微球的混合液作为内相，油相作为外相；通过调节内、外相溶液的流速，利用液体的剪切力形成油包水的液滴模板微球；

15、优选的，主体材料的浓度为2wt％～5wt％，水溶液；

16、优选的，模板微球的浓度为1mg/ml～10mg/ml；

17、优选的，若模板微球为聚苯乙烯微球，其粒径为100nm～70um；

18、优选的，若模板微球为二氧化硅微球，其粒径为50nm～20um；

19、优选的，若模板微球为三聚氰胺微球，其粒径为100nm～15um；

20、优选的，内相的流速为0.1ml/h～1ml/h；

21、优选的，外相的流速为1.5ml/h～30ml/h；

22、步骤二，主体材料的固化：将步骤一制备得到的液滴模板微球在紫外光下照射，聚合内相溶液；或者是，将步骤一制备得到的液滴模板微球放入固化液中，获得稳定的大孔微载体架构；

23、优选的，紫外光照射时间为20s～120s；

24、优选的，固化时间为1min～5min；

25、步骤三，模板微球的去除：将步骤二制备得到的产物干燥后，放入溶液中去除模板微球；或者是，将步骤二制备得到的产物放入溶液中去除模板微球后进行干燥；

26、优选的，溶解模板微球的时间为30min～120min；

27、优选的，溶解模板微球的温度为20℃～40℃。

28、本发明第二个目的是所述的微载体在细胞培养中的应用。

29、本发明的有益效果在于：大孔微载体的内腔尺寸分布广，可从几十纳米到几十微米，且孔径和数量能够通过模板微球的大小和浓度进行调控；本发明延用牺牲模板法，以粒径均一球形度好的单分散纳/微米尺度的微球作为牺牲模板，仅需两相微流控，即可获得内腔，并使得大孔结构在整个工艺过程中稳定，有利于进一步控制内腔的数量和大小，且内腔的形貌不受流速等条件改变。本发明涉及到的大孔微载体制备方法简单、操作简易、尺寸可控、可稳定量产。

技术特征：

1.一种基于微流控的大孔细胞培养微载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，主体材料选自胶原、壳聚糖、海藻酸盐、琼脂糖、聚甲基丙烯酸羟乙酯、微晶纤维素、聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯酰明胶、丙烯酰胺、n-异丙基丙烯酰胺中的一种或多种；所述模板微球选自聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、三聚氰胺微球中的一种或多种；所述油相选自液体石蜡、硅油、氟化油、棕榈油中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，固化液选自戊二醛、乙醇、钙离子溶液、碱液、酸液中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，所述溶液选自甲苯、二氯甲烷、丙酮、n,n-二甲基甲酰胺、氢氟酸、乙酸、甲酸、盐酸、磷酸、碱液中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中主体材料的浓度为2wt％～5wt％，模板微球的浓度为1mg/ml～10mg/ml。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述模板微球为聚苯乙烯微球时，其粒径为100nm～70μm，或所述模板微球为二氧化硅微球时，其粒径为50nm～20μm，或所述模板微球为三聚氰胺微球，其粒径为100nm～15μm。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，内相的流速为0.1ml/h～1ml/h；外相的流速为1.5ml/h～30ml/h。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中紫外光照射时间为20s～120s，固化时间为1min～5min。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中去除模板微球的时间为30min～120min，溶解模板微球的温度为20℃～40℃。

10.根据权利要求1-9任一项所述的制备方法得到的微载体在细胞培养中的应用。

技术总结本发明涉及一种基于微流控的大孔细胞培养微载体的制备方法，属于生物材料技术领域。本发明涉及的细胞培养大孔微载体包括主体材料层和微球内腔：以微球作为牺牲模板，混入主体材料层，基于微流控技术制备粒径均一的液滴，待主体材料固化后，去除牺牲模板，以制备粒径均一、内腔数量及大小可调节的大孔微载体。技术研发人员：陈思语,张文冬,曹飞婷受保护的技术使用者：常州天地人和生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/2