调控植物抗旱性的方法及MdCYP86A4在调控植物抗旱性中的应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种调控植物抗旱性的方法及mdcyp86a4在调控植物抗旱性中的应用。

背景技术：

1、逆境指对植物生长和生存不利的各种环境因素的总和，又称为胁迫。逆境的种类包括非生物胁迫(物理胁迫、化学胁迫)和生物胁迫。逆境会引起细胞脱水、生物膜破坏、各种代谢无序进行，导致植物代谢失调。在植物抵抗非生物胁迫的过程中，通过细胞感受逆境信号、传导逆境刺激、激活一系列分子途径并调控相关基因表达和生理反应等阶段适应逆境，在逆境中获得抗逆性。

2、在各种非生物胁迫中，干旱对植物的影响尤为突出，是制约植物生长的最主要非生物胁迫。干旱使细胞过度脱水、膜破坏，正常生理生化代谢受阻、细胞受到机械性损伤。如何通过基因工程的手段调控植物的抗旱性受到了本领域技术人员的关注。

技术实现思路

1、本发明提供一种调控植物抗旱性的方法及mdcyp86a4在调控植物抗旱性中的应用。

2、第一方面，本发明提供一种调控植物抗旱性的方法，包括：调控出发植株中mdcyp86a4蛋白的活性和/或mdcyp86a4蛋白的含量和/或mdcyp86a4蛋白编码基因的表达，使得到的转基因植株的抗旱性不同于出发植株；

3、所述mdcyp86a4蛋白是如下a1)-a3)中任一种蛋白质：

4、a1)氨基酸序列如seq id no:2所示的蛋白质；

5、a2)将seq id no:2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质；

6、a3)在a1)或a2)的n末端和/或c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白。

7、本发明将seq id no:2所示的蛋白质命名为mdcyp86a4蛋白，其来源于苹果(malusdomestica)。

8、本发明中，蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

9、本发明中，所述抗旱性具体可表现为植物在干旱胁迫下的叶片黄化程度降低，也可表现为植物在干旱胁迫下的mda含量、h2o2含量和/或o2-含量的降低。

10、如上所述的方法，所述调控为上调或增强或提高，或者为下调或抑制或降低。在一种具体实施方式中，所述调控为上调或增强或提高出发植株中mdcyp86a4蛋白的活性和/或mdcyp86a4蛋白的含量和/或mdcyp86a4蛋白编码基因的表达。

11、进一步地，所述调控包括上调或增强或提高出发植株中mdcyp86a4蛋白编码基因的表达。更进一步地，所述上调或增强或提高出发植株中mdcyp86a4蛋白编码基因的表达包括：向出发植株中导入所述mdcyp86a4蛋白的编码基因，上调或增强或提高出发植株中所述mdcyp86a4蛋白编码基因的表达。

12、具体地，向出发植株中导入所述mdcyp86a4蛋白的编码基因可通过农杆菌介导法完成；具体地，将携带所述mdcyp86a4蛋白的编码基因的重组表达载体导入农杆菌细胞中，并将携带有重组表达载体的农杆菌侵染出发植株，从而得到过表达mdcyp86a4蛋白的编码基因的转基因植株。

13、进一步地，携带所述mdcyp86a4蛋白的编码基因的重组表达载体可为如下重组质粒：将pri-101-an载体中smaⅰ和kpnⅰ识别位点之间的小片段取代为所述mdcyp86a4蛋白的编码基因，而保持pri-101-an载体的其它核苷酸不变得到的重组质粒。

14、更进一步地，所述mdcyp86a4蛋白的编码基因是如下b1)或b2)：

15、b1)核苷酸序列如seq id no:1所示的核酸分子；

16、b2)与seq id no:1所示的dna分子具有80％以上的同一性，且编码seq id no:2所示的蛋白质的dna分子。

17、本发明中，同一性是指氨基酸序列和核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

18、本发明中，所述80％以上的同一性可以为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

19、在一种具体实施方式中，所述调控为下调或抑制或降低出发植株中mdcyp86a4蛋白的活性和/或mdcyp86a4蛋白的含量和/或mdcyp86a4蛋白编码基因的表达。进一步地，所述调控包括下调或抑制或降低出发植株中mdcyp86a4蛋白编码基因的表达。更进一步地，所述下调或抑制或降低出发植株中mdcyp86a4蛋白编码基因的表达可通过基因敲除或基因沉默的方法。更进一步地，可选取seq id no:1所示的核苷酸序列的第1334-1608位的序列，将其反向互补之后作为干扰序列，并将干扰序列插入到植物表达载体中，获得重组表达载体；通过农杆菌介导法等方法将重组表达载体导入农杆菌中，并将携带有重组表达载体的农杆菌侵染出发植株，获得下调或抑制或降低mdcyp86a4蛋白编码基因表达的转基因植株。

20、进一步地，上述重组表达载体为如下重组质粒：将seq id no:1所示的核苷酸序列的第1334-1608位的序列的反向互补序列替换pri-101-an表达载体smaⅰ和kpnⅰ酶切位点之间的小片段，构建得到重组质粒。

21、第二方面，本发明提供上述任一所述mdcyp86a4蛋白、调控所述mdcyp86a4蛋白的活性和/或mdcyp86a4蛋白的含量和/或mdcyp86a4蛋白编码基因的表达的物质在如下任一方面的应用：

22、c1)调控植物蜡质合成中的应用；

23、c2)调控植物表皮通透性中的应用；

24、c3)提高植物抗逆性中的应用；

25、c4)提高植物抗旱性中的应用；

26、c5)提高植物对aba敏感性中的应用；

27、c6)植物育种中的应用。

28、第三方面，本发明提供一种培育转基因植物的方法，包括：调控出发植株中上述任一所述mdcyp86a4蛋白的活性和/或mdcyp86a4蛋白的含量和/或mdcyp86a4蛋白编码基因的表达，得到转基因植株；

29、所述转基因植株中蜡质的含量和/或表皮通透性和/或抗旱性不同于所述出发植株。

30、如上所述的方法，所述调控为上调或增强或提高，或者为下调或抑制或降低。

31、在一种具体实施方式中，所述培育转基因植物的方法还包括在得到转基因植株后培育转基因植株的步骤。调控所述mdcyp86a4蛋白的活性和/或mdcyp86a4蛋白的含量和/或mdcyp86a4蛋白编码基因的表达的方法如前所述。

32、如上所述的方法，还可包括对转基因植株进行分子鉴定和性状评估，以确认mdcyp86a4蛋白的编码基因在转基因植株中的表达量是否被调控；也可以通过抗旱性实验评估转基因植株是否具备预期的抗旱性。

33、如上所述的方法，所述培育转基因植株的步骤可包括通过交配、杂交等技术，将转基因植株进行后代培育和品种改良，以及进行后续的种植和生产。

34、本发明中，上述任一所述植物为如下任一种：

35、d1)双子叶植物；

36、d2)蔷薇科；

37、d3)苹果属；

38、d4)苹果。

39、可以理解，上述植物也可以为十字花科植物。进一步地，上述植物为拟南芥属植物。更进一步地，上述植物为拟南芥。

40、第四方面，本发明提供调控上述任一所述mdcyp86a4蛋白的活性和/或mdcyp86a4蛋白的含量和/或mdcyp86a4蛋白编码基因的表达的物质。

41、本发明中，调控所述mdcyp86a4蛋白编码基因的表达的物质包括含有上述蛋白编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或重组菌。

42、本发明中，上述物质还包括用于扩增调控上述mdcyp86a4蛋白编码基因表达的物质的引物对。在一种具体实施方式中，当所述调控为上调或增强或提高时，以seq id no:1所示的mdcyp86a4蛋白编码基因为模板，用于扩增该目的基因的引物对包括第一引物和第二引物，第一引物的核苷酸序列如seq id no:5所示，第二引物的核苷酸序列如seq id no:6所示。

43、在一种具体实施方式中，当所述调控为下调或抑制或降低时，以seq id no:1所示的核苷酸序列的第1334-1608位的序列为模板，用于扩增该目的基因的引物对包括第三引物和第四引物，第三引物的核苷酸序列如seq id no:7所示，第四引物的核苷酸序列如seqid no:8所示。

44、本发明中，上述物质包括用于检测上述mdcyp86a4蛋白编码基因表达量的引物对。在一种具体实施方式中，用于检测mdcyp86a4蛋白编码基因表达量的引物对包括第五引物和第六引物，所述第五引物的核苷酸序列如seq id no:9所示，所述第六引物的核苷酸序列如seq id no:10所示。

45、本发明通过调控mdcyp86a4蛋白编码基因的表达量，并在模式生物拟南芥和苹果愈伤组织中验证，过表达mdcyp86a4有助于提高植株中的蜡质含量、改善植株叶片的表皮通透性、提高植株的抗旱性。因此，本发明所提供的mdcyp86a4蛋白在调控植物抗旱性中具有重要的应用价值，具有一定的应用空间和市场前景。