香蕉枯萎病菌AST2基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

本发明属于基因工程，具体涉及香蕉枯萎病菌ast2基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

背景技术：

1、香蕉(musa spp.)是全球贸易量最大的鲜食水果之一，。然而香蕉枯萎病菌热带4号生理小种(fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race4，foc tr4)的爆发和蔓延不仅造成了巨大的经济损失，更是成为香蕉产业可持续发展的最重要限制因素。因此如何有效地防控香蕉枯萎病已成为香蕉产业首要问题之一。香蕉枯萎病的防控从抗病育种、生物防治及农事操作等方面进行了很多尝试，均没有突破性的进展。由于化学防治具有经济、直接、快速等优点，仍是田间防治香蕉枯萎病的主要方式。然而目前使用的杀菌剂中有85％是单靶点杀菌剂，并且可以通过单靶点突变而具有抗药性如唑类、琥珀酸脱氢酶抑制剂类(sdhi)和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(qoi)等。

2、研究表明foc tr4对常规的单靶点化学杀菌剂如多菌灵等具有抗性，这些杀菌剂均无法完全杀死孢子，而存活的孢子最终仍会导致香蕉发病。目前香蕉枯萎病田间防控主要使用混合药剂，尽管其防治效果比单一使用单靶点杀菌剂更好，但田间防控效果依旧不明显。而多位点杀菌剂虽然可以通过多种方式干扰未知的细胞过程，但也伴随着毒性的增加，对环境十分不友好。香蕉作为经济作物，不仅果实可用于鲜食，其假茎和叶片也被用作青贮饲料，这些用途要求杀菌手段应具有高活性、低抗药性、对环境友好及对非靶标生物安全等特点。研究表明，将新的靶标作为新农药研发的突破口可以有效降低成本，缩短药物创制时间，增加其高效性。

3、新靶标及化学实体的持续创新依然是绿色农药创制的重要途径。通过美国食品药品监督管理局的资料显示，过去二十年间，70％的新药是基于靶标与药物结合的方法发现的。1970年萎锈灵作用靶标的发现，导致后续各大农药企业基于这一靶标结合生物学开发出结构多样、广谱、高效的琥珀酸脱氢酶抑制剂(sdhis)；明确药物在病原菌上靶点不仅可以创制新药物，还可以通过这些靶点合成dsrna或sirna，喷洒于植物表面，供真菌吸收、抑制靶标基因表达，从而抑制病害发生，实现绿色防控。潜在靶标的功能与结构分析是开发新型绿色农药的基础。

4、天冬氨酸转氨酶在细胞中分为两类，一类是细胞质天冬氨酸转氨酶(ast1)，该酶的作用是将细胞质中谷氨酰胺衍生的天冬氨酸(asp)和α-酮戊二酸分别转化为谷氨酸和草酰乙酸；另一类是线粒体天冬氨酸转氨酶(ast2)，其与细胞质天冬氨酸转氨酶(ast1)的序列相似性不高(图9)，线粒体天冬氨酸转氨酶在线粒体中将谷氨酸和草酰乙酸催化为天冬氨酸(asp)和α-酮戊二酸(α-kg)，该酶是苹果酸天冬氨酸穿梭的成员，参与了核苷酸的合成，氧化还原稳态，并能促进三羧酸(tca)循环、脂肪酸转运、氮平衡以及硫分解代谢。现有研究主要集中于研究细胞质天冬氨酸转氨酶(ast1)，而关于线粒体天冬氨酸转氨酶focast2的功能研究较少。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供香蕉枯萎病菌ast2(focast2)基因在影响香蕉枯萎病致病力中的应用；通过阻断或抑制香蕉枯萎病菌ast2基因及其表达产物可以防治香蕉枯萎病菌致病。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一方面，提供focast2基因或其表达产物在降低香蕉枯萎病菌致病力中的应用；所述focast2基因的序列如seq id no.9所示。

4、优选地，所述应用通过阻断或抑制focast2基因或其表达产物的表达，从而降低香蕉枯萎病菌致病力。

5、优选地，所述表达产物包括focast2基因表达形成的蛋白质。

6、优选地，所述香蕉枯萎病菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种。

7、优选地，所述应用包括通过基因工程方法敲除或者敲减focast2基因实现，被敲除序列为如seq id no.9所示的focast2基因序列全部。

8、优选地，所述基因工程方法包括同源重组方法。

9、优选地，所述同源重组方法为同源双交换重组技术。

10、优选地，所述同源重组方法包括：

11、1)以香蕉枯萎病菌foc tr4 ii5基因组模板，引物uf和ur扩增ast2基因上游片段，引物df和dr扩增ast2基因下游片段；

12、2)将上、下游片段与潮霉素片段进行pcr融合；

13、3)利用nf和nr引物进行扩增，获得focast2上游-潮霉素片段(hph)-focast2下游的dna片段；将制备的dna片段加入原生质体中，获得focast2基因缺失的突变体菌株。

14、其中当重组dna片段进入原生质体后，利用同源重组原理，将基因组中待敲除基因片段置换出来，同时重组dna片段上的潮霉素抗性基因等重组元件也整合到基因组中。可使用重组元件中潮霉素抗性标记进行阳性重组克隆的筛选，获得focast2基因的缺失突变体菌株。

15、优选地，所述uf的序列如seq id no.1所示，所述ur的序列如seq id no.2；所述df的序列如seq id no.5所示；所述dr的序列如seq id no.6所示；所述nf的序列如seq idno.3所示；所述nr的序列如seq id no.7所示。

16、本发明的第二方面，提供focast2基因作为防治香蕉枯萎病的药物的靶标的应用，所述药物阻断或抑制focast2基因或其表达产物的表达。

17、本发明的第三方面，提取focast2抑制剂在制备防治香蕉枯萎病的药物中的应用。

18、优选地，所述药物通过抑制focast2基因或其表达产物的表达，从而降低香蕉枯萎病菌致病力。

19、优选地，所述抑制剂包括抑制focast2基因表达的试剂和/或使focast2蛋白活性降低或失活的试剂。

20、优选地，所述抑制剂可以包括但不限于核酸抑制物、蛋白抑制剂、蛋白水解酶、蛋白结合分子、其能够在蛋白或基因水平上下调focast2基因或其编码的蛋白的表达或活性。

21、例如，所述抑制剂可以包括sgrna、sirna、dsrna、mirna、cdna、反义rna/dna、低分子化合物、肽、抗体等中的至少一种。

22、优选地，所述化合物包括阿苯达唑或其药学上可接受的盐。

23、优选地，所述sirna的序列为：

24、sirnasense：uucccauaaggcacuuuguaa(seq id no.10)；

25、sirnaantisense：guucacaaagugccuuaugggaa(seq id no.11)。

26、优选地，所述抑制剂还包括含有上述focast2基因的敲除载体。

27、优选地，所述抑制剂通过有效抑制或沉默focast2基因的表达，从而能够有效降低香蕉枯萎病菌致病力。

28、优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料，该载体或辅料可为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂中的一种或多种。

29、本发明的第四方面，提供一种降低香蕉枯萎病致病力或防治香蕉枯萎病的方法，包括阻断或抑制focast2基因或其表达产物的表达。

30、本发明的有益效果是：

31、本发明公开了focast2基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。本发明利用同源重组的原理，将该基因focast2进行敲除；利用peg介导的原生质体转化的方法，获得了敲除体。结果发现focast2基因敲除导致菌丝生长出现卷曲等生长畸形、显著影响菌株产孢量、α-酮戊二酸含量降低、h2o2含量升高、致病力下降；说明敲除focast2基因后影响了香蕉枯萎病菌的生长、降低了其致病力。本发明有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。