一种用于合成α-熊果苷的重组菌以及α-熊果苷的生物合成方法和应用

本发明涉及一种用于合成α-熊果苷的重组菌以及α-熊果苷的生物合成方法和应用，属于生物化工领域。

背景技术：

1、目前，α-熊果苷(α-arbutin)广泛应用于美容领域，其美白、淡化色斑、保湿和抗衰老功效备受瞩目。其通过抑制酪氨酸酶活性抑制，减少黑色素生成减少，改善肤色不均和减少色斑。同时，α-熊果苷的保湿性质有助于维持皮肤水分，赋予肌肤柔滑和弹性。此外，α-熊果苷还具有抗衰老的特性，通过减少自由基生成提供皮肤抗氧化保护，减缓皮肤老化。这些美容功效使得α-熊果苷成为护肤品中不可或缺的成分之一。

2、目前，α-熊果苷的工业合成主要通过酶催化合成以及生物转化两种方法实现。酶催化合成通过使用酶作催化剂将特定底物转化为α-熊果苷，此法高效且具选择性，提升了产品的纯度。生物转化法通过利用微生物或真菌的代谢途径转化底物为α-熊果苷。该方法环境友好，可通过工程微生物提高产量及产品质量。但是，现有的生物转化法制备α-熊果苷的方案中，均存在着产量低的问题，例如中国专利cn106148256b公开了产α-熊果苷的基因工程菌及其构建方法和应用，其利用大肠杆菌为宿主，pet28a为载体进行淀粉蔗糖酶的表达，最终重组菌的最高α-熊果苷产量仅为45.36g/l，仍处于较低水平。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、本发明要解决的技术问题是：提供一株能够高效生物转化生产α-熊果苷的重组菌，以及利用该重组菌生产α-熊果苷的方法。

3、本发明首先提供了一种重组菌，所述重组菌以大肠杆菌为出发菌株，表达了氨基酸序列如seq id no.1所示的蔗糖磷酸化酶。

4、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌(escherichia coli)bl21。

5、在一种实施方式中，所述重组菌以pet-28a质粒为表达载体，表达所述蔗糖磷酸化酶的编码基因。

6、本发明还提供了一种α-熊果苷生产方法，所述方法包括：以蔗糖和对苯二酚为底物，利用上述重组菌催化合成α-熊果苷。

7、在一种实施方式中，所述催化的反应条件为：ph 6～7.5，温度20～37℃；所述对苯二酚和蔗糖的摩尔比为1：(1～4)；所述重组菌在催化合成反应体系中的od600为10～40。

8、在一种实施方式中，所述催化的反应条件为：ph 7，温度20℃；所述对苯二酚和蔗糖的摩尔比为1:2；所述重组菌在催化合成反应体系中的od600为40。

9、在一种实施方式中，所述对苯二酚的浓度为20～30g/l。可选的，所述对苯二酚的浓度为25g/l。

10、在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

11、(1)种子培养：将所述重组菌接种于种子培养基，培得到种子液；

12、(2)发酵：将步骤(1)所得种子液转接于发酵培养基，于35～40℃培养1～3h，添加iptg，降低温度至16～25℃，继续培养20～30h；

13、(3)催化：收集步骤(2)发酵所得菌体，清洗，加入底物，进行催化反应，合成α-熊果苷。

14、在一种实施方式中，所述催化反应的时间为不低于24h。

15、在一种实施方式中，所述方法还包括：每催化10～12h，收集菌体，清洗菌体，重新进行催化反应；所述催化反应的总反应时间为不低于36h。

16、在一种实施方式中，所述iptg的浓度为0.5～1.5mm。可选的，所述iptg的浓度为1mm。

17、本发明还提供上述的重组菌，或上述的方法在食品化工领域中的应用。

18、在一种实施方式中，所述应用包括将所述重组菌或所述方法用于α-熊果苷或含α-熊果苷产品的生产。

19、本发明获得的有益效果：

20、本发明提供了一种以蔗糖和对苯二酚为起始底物生物合成α-熊果苷的重组大肠杆菌，所述重组菌在ph 7，温度20℃，对苯二酚和蔗糖的摩尔比为1:2，重组菌在催化合成中的od600为40的条件下，反应24h，α-熊果苷的产量达到了57.0g/l，转化率达到了93.4％。进一步的，每催化12h，收集菌体，重复投料反应，反应总时间为36h时，α-熊果苷的产量达到了158.8g/l，转化率达到86.8％。本发明为后续生物法生产α-熊果苷及其他糖苷提供了有益的参考和借鉴。

技术特征：

1.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌为出发菌株，表达了氨基酸序列如seq id no.1所示的蔗糖磷酸化酶；所述大肠杆菌包括大肠杆菌(escherichia coli)bl21。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以pet-28a质粒为表达载体，表达所述蔗糖磷酸化酶的编码基因。

3.一种α-熊果苷生产方法，其特征在于，所述方法包括：以蔗糖和对苯二酚为底物，利用权利要求1或2所述的重组菌催化合成α-熊果苷。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述催化的反应条件为：ph 6～7.5，温度20～37℃；所述对苯二酚和蔗糖的摩尔比为1：(1～4)；所述重组菌在催化合成反应体系中的od600为10～40。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述催化的反应条件为：ph 7，温度20℃；所述对苯二酚和蔗糖的摩尔比为1:2；所述重组菌在催化合成反应体系中的od600为40。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述对苯二酚的浓度为20～30g/l。

7.根据权利要求4～6任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，方法还包括：每催化10～12h，收集菌体，清洗菌体，重新进行催化反应；所述催化反应的总反应时间为不低于36h。

9.权利要求1或2所述的重组菌，或权利要求3～8任一所述的方法在食品或化工领域中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括将所述重组菌或所述方法用于α-熊果苷或含α-熊果苷产品的生产。

技术总结本发明公开了一种用于合成α‑熊果苷的重组菌以及α‑熊果苷的生物合成方法和应用，属于生物化工领域。本发明以蔗糖和对苯二酚为起始底物生物合成α‑熊果苷的路径。对重组菌Escherichia coli BL21的蔗糖磷酸化酶基因的表达进行了优化，进一步提高了α‑熊果苷的产量。通过全细胞催化条件的优化，确定了最佳的催化条件，在最佳条件下，α‑熊果苷的产量达到158.8g/L，转化率达到86.8％。本发明为后续生物法生产α‑熊果苷及其他糖苷提供了有益的参考和借鉴。技术研发人员：邓禹,周胜虎,吴涵,毛银,赵运英,李国辉受保护的技术使用者：江南大学技术研发日：技术公布日：2024/9/2