用于可视化检测VanA型耐万古霉素屎肠球菌的引物探针组合及其应用的制作方法

本发明涉及耐万古霉素屎肠球菌检测领域，具体为用于可视化检测vana型耐万古霉素屎肠球菌的引物探针组合及其应用。

背景技术：

1、肠球菌是一类广泛存在于自然界的革兰阳性菌，呈短链状，无芽孢及荚膜，能够在恶劣的条件下生存，其作为全球医疗保健相关感染的主要原因，与人类健康密切相关。肠球菌是人类胃肠道的共生菌，具有致病性，可引起菌血症、心内膜炎、尿路感染、腹腔内和盆腔感染，以及腹膜炎、皮肤感染、皮肤结构感染和中枢神经系统感染等。肠球菌的细胞壁坚硬厚实，对许多抗生素表现为固有耐药，又因其具有较强“可塑性”的基因组，可通过转座子和质粒产生获得性耐药，患者一旦感染，可供选择的治疗药物很有限。粪肠球菌和屎肠球菌是最常见的院内感染肠球菌，其中屎肠球菌具有更广泛的抗生素耐药性。近年来，由于广谱抗生素尤其是万古霉素的大量应用，导致了耐万古霉素肠球菌，特别是耐万古霉素屎肠球菌(vancomycin-resistant enterococcus faecium，vrefm)的出现。中国vrefm分离率虽较低，但是其感染后，临床治疗困难，致死率较高。

2、万古霉素耐药性的产生是由于操纵子编码的酶表达的前体结构中c-末端的d-丙氨酸残基被d-乳酸或d-丝氨酸取代，因此降低了原有宿主产生的前体对万古霉素的高亲和力，从而消除与万古霉素结合的靶位，导致了耐药性的产生。目前，耐万古霉素肠球菌耐药表型和基因型有vana、vanb、vanc、vand、vane、vang、vanl、vanm和vann 9种，其中vana和vanb最具临床意义。vana和vanb表型的基因组非常相似，都是由转座子tn1546上携带的抗性遗传决定因素获得的结果。但vana对万古霉素和替考拉宁均呈现高水平耐药性，而vanb对万古霉素具有耐药性，对替考拉宁敏感。vana型在耐糖肽类抗生素的肠球菌耐药基因型中最为常见，也是目前唯一能够从金黄色葡萄球菌中检测出的耐药基因型，因此，对vana基因型的感染控制具有较大的临床意义。

3、目前，传统的细菌药敏法和分子生物学检测方法是临床实验室用于检测vrefm的主要方法。细菌药敏法包括琼脂稀释法、纸片扩散法、肉汤稀释法和自动化药敏检测仪等。中国vrefm感染防治专家共识和美国实验室标准协会均推荐琼脂稀释法作为标准检测法。此方法错误率低且检验成本便宜，相较于其它药敏培养法漏检率更低，能准确检测全部基因型vrefm。但是琼脂筛选法中细菌培养时间需要24-48小时，时效性已经无法满足早期应用针对性抗生素治疗vrefm以降低其高病死率的需求。聚合酶链式反应及其衍生技术作为分子生物学检测vrefm的主要方法，具有快速、灵敏度较高等特点，目前已经可以覆盖大部分基因型vrefm检测。但其难以摆脱实验室限制，无法满足现场快速检测的需要。因此，需要寻找一种快速、实时、准确的方法用于病原菌的检测。

4、重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinantpolymerase amplification，rpa)是一种不依赖精密仪器、可在室温下完成核酸扩增的技术，其扩增体系中主要包括来源于t4噬菌体的重组酶uvsx、单链结合蛋白gp32、辅酶uvsy和来源于枯草芽孢杆菌的dna聚合酶bsu。首先，在atp供能条件下，重组酶uvsx在辅酶uvsy帮助下与rpa引物结合形成重组酶-引物复合物，寻找靶基因上的同源序列；随后与其结合形成d环结构，同时为防止进一步替换，被替换的dna链与gp32结合维持d环稳定；最后，重组酶uvsx脱离，dna聚合酶与暴露的引物3'端结合，实现靶基因扩增。目前，rpa已在重要病原微生物检测方面有了较多应用，包括检测鼠疫、炭疽、埃博拉病毒等，但未见用于检测耐万古霉素屎肠球菌的报道。

5、侧向流动试纸条(lateral flow strips，lfs)是一种以纳米胶体金颗粒作为信号标签、操作简便的纸基poct装置。将rpa与lfs技术相结合，可打破实验室限制，除了保持了核酸检测固有的高特异性及高灵敏度外，可在短时间内快速扩增和可视化检测靶基因。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的局限性，提供用于可视化检测vana型耐万古霉素屎肠球菌的引物探针组合及其应用，以解决上述背景技术提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明提供了用于可视化检测vana型耐万古霉素屎肠球菌的引物探针组合，包括vana-f/r/p引物探针组合；

3、所述vana-f/r/p引物探针组合中：

4、vana-f的序列为：gtcggttgtgcggtattgggaaacagtgcc；

5、vana-r的序列为：biotin-ctcgctcgtctgctgaaaggtctgcgggaa；

6、vana-p的序列为：fitc-gtcggttgtgcggtattgggaaacagtgcc[h]cgttagctgttggcg-/c3-spacer/。

7、一种vana-f/r/p引物探针组合在vana型耐万古霉素屎肠球菌rpa-lfs检测中或检测试剂盒制备中的应用。

8、进一步的，所述vana-f/r/p引物探针组合在vana型耐万古霉素屎肠球菌的rpa-lfs的检测中为最佳的引物探针组合。

9、本发明建立了一种基于重组酶聚合酶等温扩增技术结合侧向流动试纸条技术的vana型耐万古霉素屎肠球菌快速检测方法，该方法在30分钟内可以完成检测，与其他病原菌无交叉反应，特异性强。应用于临床样本的检测时，该方法与pcr和琼脂稀释法检测结果准确性一致，耗费时间较短，对vana型耐万古霉素屎肠球菌的预防及鉴定具有重要的意义。

10、本发明的有益效果是：本方法首先以vana基因为靶点设计了5对引物，并通过琼脂糖凝胶电泳对其扩增性能及引物二聚体的形成情况进行了初步筛选；然后根据筛选出的最适引物对设计探针。为避免引物二聚体产生假阳性信号，通过对引物和探针的序列修改消除引物二聚体；对体系进行了严格的功效测试，从而建立了一种改进的rpa-lfs系统；改进的rpa-lfs方法能够在37℃恒温条件下6min内完成扩增过程，lfs可在1min内观察到肉眼可见的结果；该方法灵敏度高，对vrefm的最低检出限为1.066cfu/μl，并且与其他病原菌无交叉反应。应用该rpa-lfs方法于临床样本，该方法与pcr和琼脂稀释法检测结果准确性一致，但耗时较短。本发明建立的用于鉴定vana型耐万古霉素屎肠球菌的rpa-lfs方法操作简便，具有高度特异性和灵敏度，只需一台水浴锅就可以实现现场即时检测。该发明可为及时制定合理的抗菌治疗方案提供信息，具有很大的临床应用潜力。

技术特征：

1.用于可视化检测vana型耐万古霉素屎肠球菌的引物探针组合，其特征在于：包括vana-f/r/p引物探针组合；

2.一种如权利要求1所述的vana-f/r/p引物探针组合在vana型耐万古霉素屎肠球菌rpa-lfs检测中或检测试剂盒制备中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述vana-f/r/p引物探针组合在vana型耐万古霉素屎肠球菌的rpa-lfs的检测中为最佳的引物探针组合。

技术总结本发明公开了用于可视化检测VanA型耐万古霉素屎肠球菌的引物探针组合及其应用。本发明首先以耐万古霉素屎肠球菌的VanA基因为目标靶点设计了5组候选引物对，通过基础型RPA反应和琼脂糖凝胶电泳，根据引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况筛选最适引物对。根据筛选出的最适引物对设计特异性的探针，通过对引物和探针的碱基错配消除假阳性信号。对该检测体系进行了严格的功效测试，确定了最佳反应时间和温度，从而建立了一种改进的RPA‑LFS系统。该方法与PCR和琼脂稀释法检测结果一致。本方法具有较高的灵敏度和特异性，只需一台水浴锅就可完成检测，可为及时制定合理的治疗方案提供关键证据。技术研发人员：高绪柱,季拓,高玉芝受保护的技术使用者：连云港市第二人民医院（连云港市临床肿瘤研究所）技术研发日：技术公布日：2024/9/2