一种与大豆高产耐盐性状相关的SNP位点、分子标记及其应用

本发明属于生物，尤其涉及基因功能分子标记，更尤其涉及一种与大豆高产耐盐性状相关的snp位点、分子标记及其应用。

背景技术：

1、本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。

2、土壤盐渍化是制约农业生产的重要因素。寻找耐盐植物有利于应对土壤盐渍化。

3、植物耐盐性是复杂的数量性状，一般受到多基因的控制，并且与一些不良性状紧密连锁，传统大豆种质资源筛选是根据大豆在盐胁迫下的表型进行鉴定，受到遗传特性和环境影响，这种方式费时耗力且准确性不高。

4、lea蛋白是植物广泛存在的一类小分子亲水性蛋白,自从首次从棉花胚胎中分离出以来,经过几十年的研究,越来越多的研究表明,植物lea蛋白广泛地参与植物应答非生物胁迫的生理过程中,并在提高植物抗逆性方面有重要的功能。相比于通过反向遗传学研究lea蛋白的耐盐功能，目前对lea蛋白进行分子标记开发并应用于生产实践的研究鲜有报道。近年来，随着高通量测序技术的快速发展和测序成本的降低，能快速检测到更高质量和更多的变异，从而产生了海量的基因型数据，这为利用全基因组关联分析(genome-wideassociation study,gwas)和单倍型分析挖掘显著相关snp奠定了良好基础。

5、kasp(kompetitive allele specific pcr)技术基于引物末端碱基的特异性匹配对snp进行精准的双等位基因判断，因其通量高、成本低、准确性好的特点，是目前国际上主流的snp分型方法，尤其在样本量大，snp位点少时，kasp的应用特点最为显著。kasp标记总共需要3条引物，2条3'末端包含snp变异位点的正向引物(f1/f2)和1条通用反向引物r。同时在2条正向引物(f1/f2)的5'端分别加上fam和hex荧光特异性结合的标签序列，用带有不同荧光结合序列的正向引物与通用反向引物pcr扩增样品的dna，其等位变异就可以通过不同的荧光信号得以反映。

技术实现思路

1、为克服上述现有技术的不足，本发明解决的技术问题为如何开发高盐条件下与大豆株高、干重、千粒重等相关的kasp标记，进而筛选大豆耐盐品种。本发明还明确了lea蛋白家族基因gmpm30的耐盐性，鉴定与大豆高产耐盐性状密切关联的耐盐基因gmpm30的优异单倍型，为大豆高产耐盐分子育种和遗传改良提供有力的技术支持。

2、为实现上述目的，本发明的一个或多个实施例提供了如下技术方案：

3、首先，本发明提供一种筛选耐盐大豆的snp位点chr13_45015513，所述snp位点在大豆13号染色体的45,015,513bp处，所述位点的碱基为c或t。

4、本发明的一个或多个具体实施方式中，大豆参考基因组为wm82.a2.v1.0；网站链接chr13:45.01m-45.02m-genome data viewer-ncbi(nih.gov)，参考序列为gcf_000004515.4(glycine_max_v2.0)，snp变异号为rs392496489。

5、第二方面，本发明提供一种高产耐盐大豆的基因gmpm30单倍型，其所述基因gmpm30单倍型的genomic dna序列如seq id no.1所示；

6、或所述基因gmpm30单倍型的氨基酸序列如seq id no.2所示；

7、其他非优异高产耐盐单倍型编码的氨基酸序列如seq id no.3所示。

8、该单倍型位于大豆13号染色体45015110_45017621bp位置(包含过滤筛选后的snp区间，参考基因组为wm82.a2.v1.0)，其中snp 2在45,015,513bp发生了碱基c至t的替换，其中snp 2为t的单倍型的大豆产量和耐盐性显著高于其他单倍型，为gmpm30的优异单倍型。

9、利用目标基因存在的snp进行单倍型分析，并针对优异单倍型开发特异性kasp分子标记进行耐盐植株筛选，对于减少大豆育种工作量、加速大豆高产耐盐分子育种进程有极大的意义，故提出以下应用。

10、第三方面，提供检测snp位点chr13_45015513基因型的物质在如下任意一种或多种中的应用；

11、a1：鉴定或辅助鉴定高产耐盐大豆品种；

12、a2：制备鉴定或辅助鉴定高产耐盐大豆品种试剂；

13、a3：鉴定或辅助鉴定耐盐大豆品种；

14、a4：制备鉴定或辅助鉴定耐盐大豆品种试剂；

15、a5：大豆育种或辅助大豆育种；

16、a6：制备大豆育种试剂或辅助大豆育种试剂；

17、所述snp位点在大豆13号染色体的45,015,513bp处，所述位点的碱基为c或t。

18、上述应用中，所述检测snp位点chr13_45015513基因型具体可为检测大豆基因组中snp标记chr13_45015513的核苷酸种类。所述snp标记chr13_45015513的基因型为cc、tt。其中，所述cc基因型是大豆基因组中所述snp标记chr13_45015513为c的纯合型，tt基因型是大豆基因组中所述snp标记chr13_45015513为t的纯合型。

19、本发明的具体实施方式中，通过表达外源基因的方式证明，基因型为tt时大豆耐盐表型更强。

20、本发明的具体实施方式中，所述检测snp位点chr13_45015513的物质包括

21、a1)成套引物，所述成套引物由seq id no.4所示的单链dna分子或其衍生物、seqid no.5所示的单链dna分子或其衍生物和seq id no.6所示的单链dna分子组成；

22、a2)含有所述成套引物的pcr试剂；

23、a3)含有a1)或a2)的试剂盒。

24、本发明的具体实施方式中，所述seq id no.4所示的单链dna分子的衍生物为seqid no.4所示单链dna分子的5′端连接一种荧光标签得到的；

25、所述seq id no.5所示的单链dna分子的衍生物为seq id no.5所示的单链dna分子的5′端连接另一种荧光标签得到的。

26、seq id no.4:fam-gaaggtgaccaagttcatgc tcaagcggca aaggagaaga；

27、seq id no.5:hex-gaaggtcggagtcaacggatt caagcggca aaggagaagg。

28、上述应用中，反向引物如seq id no.6:tttgttgagcagctcctgtattct所示。

29、第四方面，提供snp位点chr13_45015513在培育大豆耐盐或高产耐盐品种中的应用。

30、第五方面，提供gmpm30单倍型在培育大豆耐盐或高产耐盐品种中的应用。

31、第六方面，提供一种产品，所述产品包括第三方面所述的应用中检测snp位点chr13_45015513的物质；

32、所述产品具有如下至少一种功能：

33、1)鉴定或辅助鉴定大豆在盐胁迫下的产量、鲜重或干重；

34、2)耐盐大豆的育种；

35、3)高产、耐盐大豆的育种；

36、4)选育耐盐大豆品种；

37、5)选育高产、耐盐大豆品种。

38、第七方面，提供一种鉴定或辅助鉴定耐盐或高产耐盐大豆的方法，所述方法检测代谢大豆的snp位点chr13_45015513的基因型，根据基因型确定所述大豆的耐盐性能。

39、第八方面，提供一种培育耐盐或高产耐盐大豆的方法，检测待测大豆基因组中snp位点chr13_45015513的基因型，选择tt或cc的基因型的大豆进行培育；

40、或，向大豆中转化表达seq id no.2所示氨基酸序列的质粒获得。

41、在本发明的一个或多个实施方式中，所述耐盐中的盐含量为0-180mm，优选为150mm。

42、本发明中，通过具体实验证实：将重组质粒p35s::gmpm30-oe和p35s::gmpm30-rnai转化发根农杆菌k599，随后使用注射器刺入幼苗靠近子叶的下胚轴处进行接种，接种幼苗约3-4周后获得转基因阳性毛状根，经150mm nacl处理后观察表型，结果表明本发明所述的大豆耐盐基因gmpm30的过表达植株长势好于野生型，rnai植株的长势差于wt(图2)。随后，测定其干鲜重指标发现，在nacl处理后，oe株系的干重和鲜重水平均显著高于wt(图3)。此为首次发现的gmpm30在大豆中的耐盐性。

43、统计分析表明在0和150mm nacl胁迫条件下，与携带gmpm30-hap“c”的品种相比，携带gmpm30-hap“t”的大豆品种的盐下萌发率以及苗期干鲜重均显著高于携带gmpm30-hap“c”的品种(见图5和图6)。这一结果表明gmpm30-hap“t”能够具有更强的大豆耐盐性。

44、对收获后的大豆进行室内考种，统计分析发现与携带gmpm30-hap“c”的品种相比，携带gmpm30-hap“t”的大豆品种的百粒重和单株粒重均显著高于携带gmpm30-hap“c”的品种(见图7)。这一结果表明gmpm30-hap“t”能够具有更高的盐地产量。

45、按照上述毛状根侵染方法，将重组质粒p35s::gmpm30-t和p35s::gmpm30-c转化发根农杆菌k599获得转基因阳性毛状根，经150mm nacl处理后观察表型，结果表明本发明所述的大豆耐盐基因gmpm30的优异单倍型hap“t”比hap“c”表现出更强的耐盐性(见图8和图9)，此为首次发现的gmpm30的优异单倍型。

46、本发明所述一种大豆高产耐盐基因gmpm30的耐盐优异单倍型及snp位点，并以随机筛选的186份大豆种质资源为研究材料，针对上述snp位点进行kasp标记开发，利用kasp标记引物在实时荧光定量pcr仪上对186份大豆材料进行扩增并进行基因分型，结果表明：开发的kasp标记能直接对snp位点进行特异的区分和检测，准确率高达100％，该kasp标记具有良好的应用价值，可实现对大豆耐盐性状的预先选择和分子辅助育种(见图10)。

47、以上一个或多个技术方案存在以下有益效果：

48、本发明公开的gmpm30的高产耐盐优异单倍型及其与高产耐盐性状相关的高效kasp分子标记为大豆高产耐盐品种的选育提供有力的技术支持，该分子标记对于植物高产耐盐性状的研究意义深远，在大豆高产耐盐分子育种中具有广阔的应用前景和很高的应用价值。

49、本发明附加方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。