一种检测绵羊IGF2BP2基因核心启动子区与生长性状相关的SNP分子标记的方法及其应用

本发明属于家畜分子生物学检测，具体涉及一种检测绵羊igf2bp2基因核心启动子区与生长性状相关的snp分子标记的方法及其应用。

背景技术：

1、据了解，我国绵羊种质资源丰富，但优质肉羊种源匮乏，选育进展滞后，严重影响了我国绵羊种质资源保护和肉羊产业的可持续健康发展。湖羊是我国著名的羔皮用绵羊品种，具有适应性强、繁殖率高、性成熟早、肉质鲜美等优点。杜泊羊具有生长速度快、肥育性能好、产瘦肉率高等特点，常被作为优质种公羊与湖羊、小尾寒羊等绵羊品种进行杂交培育兼具父母本优良性状的肉羊品种。以杜泊羊为父本，湖羊为母本杂交培育的苏湖肉羊兼具生长速度快、产肉率高、产羔数多、肉质好等特点，加快苏湖肉羊遗传选育进展，对我国肉羊种质创新及其产业化具有重大意义。

2、在现代家畜育种过程中，分子标记辅助选择(marker-assisted selection，mas)发挥了重要作用，能够构建基因图谱并基因定位、对疾病早期诊断减少淘汰率、进行性别鉴定和预测杂种优势等，对畜禽品种进行改良，提高经济效益。通过对个体dna标记进行分型，可以实现早期诊断选择，检测和筛选与畜禽重要经济性状相关的遗传标记，并结合系谱和表型信息筛选出生长性能、繁殖性能或产肉性能等优越的个体，提高种群遗传品质和育种值准确性，加快畜禽的品种选育进程。

3、目前，在家畜mas中，常用的分子标记有，单核苷酸多态(single nucleotidepolymorphism snp)、插入缺失(insertion/deletion，indel)和拷贝数变异(copy numbervariation，cnv)。与indel和cnv相比，单核苷酸多态性(snps)是生物体基因组中存在最广泛的一类变异，也是目前在mas中应用最为广泛的一类分子标记。snp是指基因组中单个核苷酸发生突变、缺失或插入等变化引起的多态性，具有较高的遗传稳定性，已被大量应用于遗传育种的研究中。snp的变化可能会导致其所在的基因对生物的调控发生异常，引起生物表型性状的改变。

4、目前snp基因分型的检测一般分为等位基因识别和等位基因检测，现有技术中snp基因分型的检测方法如下：

5、(1)质谱检测技术是目前应用最广泛的snp检测方法之一，具有快速检测、易于自动化、分辨率高的特点，应用前景广阔；(2)高通量测序技术适用于高质量、高数量的基因组序列；(3)基因芯片法可以将固定有大量已知snp位点探针的载体与已荧光标记的dna样品片段杂交确定snp位点，具有高通量和快高效的优点；(4)单链构象差异(sscp)利用相同长度的dna在进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，存在snp的个体，其dna电泳迁移速度与不存在snp的个体具有差异，可以进行基因分型，但其存在分辨率差的缺点，应用较少；(5)限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，rflp)技术，当snp发生在dna酶切位点时，通过相应的限制性内切酶对dna片段的扩增产物进行酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳得到不同的图谱，从而检测snp位点基因型，具有成本低、特异性高的优点。

6、igf2bp2基因(insulin-like growth factor 2mrnabinding protein2)，igf2bp2能够结合并促进igf2 mrna翻译以增加igf2蛋白表达来发挥作用，还能够通过特定的功能域结合并稳定其他基因发挥作用，如与线粒体内呼吸链cⅰ蛋白和cⅳ亚单位转录本结合，影响atp产生。各项研究发现，igf2bp2基因在畜禽的早期生长发育过程中具有重要作用，能够参与调节机体肌肉的生长，是卫星细胞激活和骨骼肌发育的关键调节因子。说明igf2bp2基因可能在苏湖肉羊生长发育过程中起着重要作用，但是igf2bp2基因影响绵羊生长发育的相关报告较少。

技术实现思路

1、本发明针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种检测绵羊igf2bp2基因核心启动子区与生长性状相关的snp分子标记的方法及应用。

2、本发明的目的之一在于，提供一种绵羊igf2bp2基因核心启动子区与生长性状相关的snp分子标记，所述snp分子标记为nc_056054.1:g.202184612位点，snp碱基差异为c或t。

3、根据琼脂糖凝胶图谱所示，所述snp分子标记包括cc、ct、tt三种基因型。

4、本发明的目的之二在于，提供一种检测绵羊igf2bp2基因核心启动子区与生长性状相关的snp分子标记的方法，包括：

5、以igf2bp2基因转录起始位点上游2000bp序列作为参考，构建igf2bp2基因启动子系列缺失载体，根据双荧光素酶试验结果，筛选出核心启动子区域；以绵羊基因组dna为模板，igf2bp2核心启动子区域序列为目的片段，进行pcr扩增，通过sanger测序和pcr-rflp法对snp进行基因分型。

6、本发明进一步优化的技术方案如下：

7、所述igf2bp2基因核心启动子区为转录起始位点上游-396bp到-1046bp区段。

8、所述snp分子标记为苏湖肉羊igf2bp2基因nc_056054.1:g.202184612位点，其pcr扩增引物对为：

9、上游引物：5′-gagttgagggggactgaacc-3′，

10、下游引物：5′-ggctgggagaccacaacttt-3′。

11、所述pcr扩增体系包括100ng/μl模板dna5μl，10mm引物对所对应的上下游引物各1μl，primestar max prmix(2×)25μl，以及去离子水18μl；反应程序为：98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s，共30个循环。

12、所述pcr-rflp法酶切pcr扩增产物的反应体系为pcr扩增产物3μl，限制性内切酶rsaⅰ0.2μl，10×nebuffer1μl，以及去离子水5.8μl；反应程序为：37℃温育15min；

13、所述snp基因分型结果为：若酶切产物为三个条带，条带长度为482bp、299bp和183bp，表示其基因型为ct型；若酶切产物为两个条带，条带长度为299bp和183bp，表示其基因型为cc型；若梅切产物只有一个条带，条带长度为482bp，表示其基因型为tt型。

14、本发明还提供了上述分子标记或检测snp分子标记的方法在苏湖肉羊分子标记发辅助选择育种中的应用。

15、上述的应用，所述snp分子标记基因型为纯合tt型的个体在生长性状或体尺性状上优于基因型为纯合cc型和基因型为杂合ct型的个体。

16、上述的应用，所述的生长性状为初生重、初生体高、6月龄体重、6月龄体长、6月龄胸围、6月龄管围。

17、本发明以苏湖肉羊igf2bp2基因转录起始位点上游2000bp序列作为参考，通过构建igf2bp2基因启动子系列缺失载体和双荧光素酶试验筛选出igf2bp2基因的核心启动子区域，并将核心启动子区域作为snp检测候选区域，通过pcr扩增技术和pcr-rflp检测法检测该snp分子标记在苏湖肉羊群体中的突变情况，并与体重和体尺等重要经济性状进行关联；基因型为tt型的个体在生长性状(初生重、初生体高、6月龄体重、6月龄体长、6月龄胸围、6月龄管围)上优于cc型和ct型的个体。研究该基因snp分子标记并将其与苏湖肉羊重要经济性状进行关联分析，可在苏湖肉羊生长发育早期有效地预测不同生长性状和体尺性状的基因型，从而缩短了育种时间，加快苏湖肉羊的育种进程，有目的性的对群体中的优良个体进行培育，快速建立遗传资源优良的苏湖肉羊种群。

18、本发明的有益效果如下：

19、(1)本发明提供的苏湖肉羊igf2bp2基因snp分子标记检测方法不受苏湖肉羊年龄的限制，可用于早期选种，根据基因型选留具有高效经济性状的个体，从而建立培育优质的群体；

20、(2)检核igf2bp2基因snp分子标记的方法准确可靠、操作简单、成本低、周期短、易推广；

21、(3)igf2bp2基因snp分子标记存在于核心启动子区域且通过比较野生型和突变型的活性，与关联分析结果一致，该snp的作用有可靠的依据。

22、(4)igf2bp2基因snp分子标记的鉴定可用于苏湖肉羊的辅助选择和分子育种，加快良种苏湖肉羊选育速度和提高苏湖肉羊种群的品质。

23、总之，本发明筛选出绵羊igf2bp2基因的核心启动子区域，并在核心启动子区域内鉴定出与绵羊生长性状相关的snp位点nc_056054.1:g.202184612(c>t)。本发明的苏湖肉羊igf2bp2基因snp位点的检测引物和具体检测方法，可高效便捷筛选出具有生长潜力的苏湖肉羊。本发明的snp分子标记可用于苏湖肉羊的辅助选择和分子育种，提高苏湖肉羊体重或体尺性状，对苏湖肉羊的选育具有重要作用。