一种猪流行性腹泻病毒重组Spike蛋白突变体及其应用的制作方法

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)重组spike蛋白突变体，本发明还涉及该突变体在制备猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗中的应用。

背景技术：

1、猪流行性腹泻病毒属于α冠状病毒，可引起猪急性腹泻、呕吐导致脱水等。

2、pedv基因组为单股正链rna，基因组大小为28-32kb，编码spike(s)、envelop(e)、membrane(m)、nucleoprotein(n)等结构蛋白。其中spike蛋白形成同源三聚体，与宿主受体结合，介导病毒进入宿主细胞，使其形成合胞体。spike蛋白可分为s1(cv777株中1-726aa)和s2(cv777株中727-1386aa)，其中的s1区域可诱导宿主产生中和抗体，s2区域的七肽重复区域(heptad repeat regions)影响pedv进入细胞，且可诱导中和抗体产生。另一方面，pedv s1区域含有抗体依赖性感染增强表位(thavorasak t et al.enhancing epitope ofpedv spike protein[j].frontiers in microbiology,2022)，通过单氨基酸替换去除这种表位有可能开发出更高效的亚单位疫苗。

3、此外，spike蛋白具有融合前构象(prefusion conformation)和融合后构象(postfusion conformation)，其中融合前构象更有利于刺激宿主产生中和抗体。以冠状病毒spike蛋白为基础的亚单位疫苗往往通过两个脯氨酸替换，将spike蛋白固定为融合前构象(pallesen j et al.,immunogenicity and structures of a rationally designedprefusion mers-cov spike antigen[j].proceedings of the national academy ofsciences,2017；tian j h et al.,sars-cov-2spike glycoprotein vaccine candidatenvx-cov2373 immunogenicity in baboons and protection in mice[j].naturecommunications,2021)。

4、基于此，本发明通过对pedv spike蛋白氨基酸突变以消除潜在的抗体有依赖性感染增强表位，同时对二级结构α螺旋之间的氨基酸进行突变以提高spike蛋白融合前构象的稳定性，结果表明，突变体能很好地进行诱导表达，而且能更好的诱导中和抗体产生，可作为亚单位疫苗抗原在pedv防控中发挥更好作用。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种猪流行性腹泻亚单位疫苗及其制备方法，以解决现有疫苗存在的免疫原性弱的问题。本发明提供了诱导中和抗体产生能力强、表达量高、易于工业化规模生产的猪流行性腹泻病毒疫苗抗原，筛选了匹配的佐剂和免疫增强剂，制备的疫苗能更好地应用于猪流行性腹泻防控。

2、为实现上述目标，本发明提供了如下技术方案：

3、一种猪流行性腹泻病毒重组spike蛋白突变体，其氨基酸序列如seq id no.1所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、制备所述重组spike蛋白突变体，免疫小鼠并检测中和抗体效价，发现突变体诱导产生的中和抗体效价(1:230.4)显著高于突变前的抗原(1:64)，因此，本发明获得的spike蛋白突变体在猪流行性腹泻的疾病防控中具有更好的应用前景。

5、本发明进一步提供一种猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗，所述疫苗含有以上所述的猪流行性腹泻病毒重组spike蛋白突变体。

6、进一步地，该疫苗还含有佐剂和免疫增强剂。

7、进一步地，所述佐剂为as03复合佐剂。

8、进一步地，所述免疫增强剂为寡聚核苷酸cpg。

9、本发明还提供了一种制备所述猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的方法，包括以下步骤：

10、(1)pcr扩增序列如seq id no.2所述的dna片段，然后克隆到表达载体pcdna3.4载体，得到含有目的基因的重组质粒；

11、(2)将重组质粒转染cho细胞，获得表达目的基因的重组细胞；

12、(3)培养重组细胞，收获培养上清；

13、(4)从培养上清分离纯化目的蛋白；

14、(5)将获得的目的蛋白与佐剂和免疫增强剂混合，得到猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗。

15、本发明的有益效果是：

16、本发明将所述载体转入悬浮cho细胞并筛选稳定转染表达目标蛋白的重组cho细胞，经过培养收获培养上清，进一步经过亲和层析获得目标蛋白，所述的稳定转染表达目标表达的重组cho细胞培养方式简单易放大、表达量高，纯化工艺简便，便于工业化生产。本发明利用悬浮cho细胞表达的s-mutant作为抗原制备的亚单位疫苗，通过动物试验验证显示该疫苗免疫原性强能诱导产生高水平的中和抗体，可用于猪流行性腹泻预防或治疗。

技术特征：

1.一种猪流行性腹泻病毒重组spike蛋白突变体，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.编码权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒重组spike蛋白突变体的基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.权利要求1所述的重组spike蛋白突变体在制备猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗中的应用。

4.一种猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗含有权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒重组spike蛋白突变体。

5.根据权利要求4所述的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗，其特征在于，还含有佐剂和免疫增强剂。

6.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂为as03复合佐剂。

7.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述免疫增强剂为寡聚核苷酸cpg。

8.一种制备权利要求4所述猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

技术总结本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒重组Spike蛋白突变体(S‑mutant)，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。S‑mutant含猪流行性腹泻病毒Spike蛋白第21～1319个氨基酸，但相比野生型Spike蛋白(Genbank登录号：ART91241)包括了10个人工设计的氨基酸突变位点，因此减少了潜在的抗体依赖性感染增强表位并提高了重组蛋白融合前构象稳定性。该突变体能很好地进行表达，而且能更高的诱导中和抗体，可作为亚单位疫苗抗原在PEDV防控中发挥作用。技术研发人员：胡玉立,孙文,冯钊,吴海超,顾素云,刘国兴,石瑛,徐欢,郑佳受保护的技术使用者：国药集团动物保健股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/2