针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的DTT-EG串联重组蛋白及其疫苗

本发明属于生物，涉及一种针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白及其疫苗。

背景技术：

1、egfr在许多人类上皮性肿瘤中过表达，如头颈癌和肺癌等，其基因异常扩增或突变导致的egfr过表达与肿瘤疾病进展、治疗反应差、预后不良和生存率差有关。由于egfr在癌症发生、发展和预后中的重要作用，因此被认为是肿瘤的一种标志性抗原，可将其作为肿瘤治疗的一个很好的靶点。目前，已经开发出了几种抗egfr相关的被动免疫疗法药物，其中临床批准的治疗药物包括小分子抑制剂如酪氨酸激酶抑制剂，以及单克隆抗体如治疗转移性非小细胞肺癌和头颈癌的西妥昔单抗和治疗转移性结肠癌的帕尼单抗。然而，小分子抑制剂的生物相容性、药代动力学和稳定性等限制了其临床应用，单克隆抗体因成本高、输液反应、需反复给药和耐药的出现等同样限制了其临床应用。因此，需要寻找更安全、更低成本和更有效的治疗方法。接种疫苗刺激抗肿瘤免疫具有易于给药和诱导持久的肿瘤特异性免疫反应等优点。免疫系统具有识别和摧毁异常细胞的天然能力，其中包括癌变细胞。接种疫苗通过主动免疫治疗egfr阳性肿瘤是一种行之有效的策略，但目前还没有获批上市相关的人用疫苗，因此egfr疫苗的研制势在必行。主动免疫治疗egfr阳性肿瘤的一种有效途径是打破对自身egfr的免疫耐受，诱导对受体阳性肿瘤的自身免疫。

2、免疫信息学是寻找针对不同抗原的潜在候选疫苗的最佳途径之一，使用计算机等方法识别和预测抗原区域不仅降低了实验成本，还节省了时间和精力，从而有助于设计更好和广泛的治疗方法。人和小鼠的egfr高度同源，在接种疫苗之前，动物体内不存在针对egfr的内源性免疫反应。此外，肿瘤在小鼠体内快速生长的能力表明，对肿瘤抗原的任何内源性免疫反应都是最小的。同时，为疫苗选择高度同源的靶序列，以确保对疫苗的反应具备交叉性而不仅仅是异种性质。egfr作为自身抗原，其免疫自耐受而引起的固有低免疫反应，需要强大的免疫刺激佐剂才能有效地激活天然免疫和获得性免疫，从而显示出对多种癌症类型的治疗效果。

3、因此，亟需开发一种新的有效的针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的的疫苗。

技术实现思路

1、为了解决所述技术问题，本发明提供了一种针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白及其疫苗，该方法适用于制备针对表皮生长因子受体egfr过表达的dtt-eg串联重组蛋白疫苗，具有良好的开发和应用前景。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供了一种针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白，所述重组蛋白从5’端到3’端依次由his标签、dtt、gslinker、eg、gslinker、eg串联组成，其中，dtt的氨基酸序列如seq id no.1所示，gslinker的氨基酸序列如seq idno.2所示，所述eg选自eg3、eg5、eg6和eg7中的一种，所述eg3、eg5、eg6和eg7的氨基酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示。

4、上述技术方案中，针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白包括：dtt-gs-eg3-gs-eg3(简称dtt-eg3)、dtt-gs-eg5-gs-eg5(简称dtt-eg5)、dtt-gs-eg6-gs-eg6(简称dtt-eg6)、dtt-gs-eg7-gs-eg7(简称dtt-eg7)。

5、在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子表达所述的针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白。

6、上述技术方案中，dtt-eg3、dtt-eg5、dtt-eg6、dtt-eg7的核苷酸序列依次如seqid no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10所示。将所述核苷酸序列分别构建在pet-28a(+)载体的ndeⅰ和bamhⅰ之间。

7、在本发明的第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体能够表达所述的针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白，所述重组表达载体含有所述的核酸分子。

8、进一步地，所述重组表达载体包括表达质粒载体、噬菌体载体和病毒载体中的一种。

9、进一步地，所述表达质粒载体为pet-28a(+)表达载体。

10、在本发明的第四方面，提供了一种工程菌或者工程化细胞，所述工程菌或者工程化细胞包含任一所述的重组表达载体。

11、在本发明的第五方面，提供了一种针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白的制备方法，所述方法包括：

12、获得针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白；

13、构建并获得所述针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白的表达质粒；

14、将所述se的表达质粒进行分泌表达和纯化，获得纯化的重组针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白。

15、在本发明的第六方面，提供了一种针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白疫苗，所述针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白疫苗包含所述的重组蛋白以及药学上接受的佐剂。

16、进一步，所述佐剂包括氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、mpl tm、il-12、氢氧化铝联合cpg odn复合佐剂、isa51vg、isa720vg、mf59、qs21、as03佐剂中的至少一种。

17、在本发明的第七方面，提供了一种所述的针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白疫苗的制备方法，所述方法包括：

18、采用所述的方法获得针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白；

19、将所述dtt-eg串联重组蛋白与佐剂混匀制备得到。

20、进一步地，所述dtt-eg串联重组蛋白与佐剂混匀中，200μl的疫苗以pbs为溶剂包含50±5μg dtt-eg重组蛋白、300±10μg铝佐剂alum以及30±5μg cpg寡核苷酸佐剂混匀制备得到。

21、更进一步地，所述dtt-eg串联重组蛋白与佐剂混匀中，200μl的疫苗以pbs为溶剂包含50μg dtt-eg重组蛋白、300μg铝佐剂alum以及30μg cpg寡核苷酸佐剂混匀制备得到。

22、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

23、本发明提供的抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd结构域的纳米抗体；

24、1、本发明提供的针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白、重组表达载体、工程菌或者工程化细胞和亚单位疫苗，通过基于计算机算法的免疫信息学表位预测工具预测并筛选人egfr-ecd抗原表位肽段，以dtt为载体蛋白构建串联重组蛋白并进行表达纯化。以alum和cpg为佐剂构建疫苗免疫小鼠，研究重组蛋白疫苗引发的体液免疫和细胞免疫反应。测定重组蛋白疫苗针对egfr的抗体滴度，在体外培养条件下以相应蛋白再次刺激对应疫苗免疫小鼠的脾淋巴细胞，检测细胞增殖、对a549细胞的杀伤和ifn-γ的释放，测定免疫小鼠外周血淋巴细胞cd4和cd8的表达情况。同时构建预防性和治疗性a549小鼠肿瘤模型，检测了dtt-eg疫苗对肿瘤的治疗效果，并通过对肿瘤组织切片h&e染色和免疫组化分析cd8+t细胞的浸润情况。综合研究重组蛋白dtt-eg疫苗的免疫原性和抗肿瘤效果。

25、2、本发明在充分借鉴肿瘤治疗研究成果基础上，通过开展蛋白表达与纯化步骤，建立了一种针对人表皮生长因子受体阳性肿瘤的dtt-eg串联重组蛋白疫苗的制备方法制备方法，

26、3、本发明方法的dtt-eg疫苗在预防性(图8)和治疗性(图9)小鼠肿瘤模型显示出对肿瘤生长具有显著的抑制作用，用于制备dtt-eg串联重组蛋白疫苗，具有良好的开发和应用前景。