一种提高热稳定性的糖基转移酶突变体及其在红景天苷合成中的应用

本发明属于酶工程，涉及一种提高热稳定性的糖基转移酶突变体及其在红景天苷合成中的应用。

背景技术：

1、红景天苷是红景天中的主要药用成分。临床研究结果表明，红景天苷不但具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射、抗病毒、抗肿瘤等主要功能，而且还具有增强注意力、提高工作效率、延缓机体衰老、防止老年疾病等功效，尤其在军事医学、航天医学、运动医学和保健医学等方面具有十分重要的应用价值，是一种极具开发前景的环境适应药物，近年来备受关注。红景天苷无毒无害，可直接作为天然保健食品或药品，也可添加到焙烤制品、肉制品、面制品、乳制品、果冻、饮料等几乎大部分食品中。红景天苷在化妆品、饲料添加剂方面也有很好的市场前景。红景天苷目前的生产方式主要有植物提取和化学合成两种。红景天生长于高寒无污染地区，野生资源珍稀，红景天苷含量很低，采用植物提取方法会破坏红景天野生的植物资源，且价格昂贵。而采用化学合成方法需要选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂等，成本较高，容易造成环境污染。

2、糖基转移酶(glycosyltransferases,gt；ec 2.4.x.y)是一类能够催化糖基部分从活化的糖基供体分子转移到特定糖基受体分子并形成糖苷键的酶。催化的糖基化反应是合成结构复杂多样同时具有生理活性功能的糖苷类化合物的关键步骤。相比化学法，糖基转移酶所介导的糖基化反应无需繁琐的保护与脱保护，无需使用红磷、溴素等对人体和环境具有危害作用的催化剂，是一种对环境友好的生物修饰方法。因此，通过糖基转移酶糖基化酪醇合成红景天苷，在有机合成领域受到越来越广泛的关注。由于多数具有重要药理药效的天然产物发现于植物中，植物源糖基转移酶成为人们的主要研究对象，然而，植物来源糖基转移酶存在表达难、包涵体严重的问题，严重限制了糖基转移酶在红景天苷合成中的应用。相比植物来源糖基转移酶，微生物源糖基转移酶容易采用酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等模式菌株异源表达，更易于实现工业化生产。申请人前期通过分子改造获得了一株能够选择性催化酪醇c8-oh发生糖基化法应生成红景天苷的糖基转移酶突变体blyjicm6(cn117551718a中的ugt突变体氨基酸序列)。然而，该酶稳定性较差，在40℃下的半衰期仅为48.1min，在申请人构建的多酶催化体系中(cn117551718a)无法长时间完成对酪醇的转化，限制了该酶在红景天苷合成中的进一步开发利用。因此，通过分子改造进一步提高微生物糖基转移酶突变体blyjic m6的热稳定性是实现红景天苷真正的酶法工业合成的关键。

技术实现思路

1、本发明针对微生物糖基转移酶稳定性差的问题，通过综合计算和定点突变的方式获得了一系列热稳定性显著提高的糖基转移酶单点突变株，并在此基础上通过组合突变，获得了一系列热稳定性进一步提高的糖基转移酶组合突变体，显著提高了红景天苷的产量。

2、本发明的第一个目的，提供一种糖基转移酶突变体，具体如下：

3、将seq id no.1所示氨基酸序列的第304位苏氨酸(thr)、第307位的甘氨酸(gly)、第309位的天冬酰胺(asn)、第123位苯丙氨酸(phe)、第344位的苏氨酸(thr)、第271位的天冬氨酸(asp)分别突变为缬氨酸(val)、丙氨酸(ala)、色氨酸(trp)、色氨酸(trp)、缬氨酸(val)、甘氨酸(gly)；或

4、将seq id no.1所示氨基酸序列的第304位苏氨酸(thr)、第307位的甘氨酸(gly)、第309位的天冬酰胺(asn)、第123位苯丙氨酸(phe)、第344位的苏氨酸(thr)分别突变为缬氨酸(val)、丙氨酸(ala)、色氨酸(trp)、色氨酸(trp)、缬氨酸(val)；或

5、将seq id no.1所示氨基酸序列的第304位苏氨酸(thr)、第307位的甘氨酸(gly)、第309位的天冬酰胺(asn)、第123位苯丙氨酸(phe)分别突变为缬氨酸(val)、丙氨酸(ala)、色氨酸(trp)、色氨酸(trp)；或

6、将seq id no.1所示氨基酸序列的第304位苏氨酸(thr)、第307位的甘氨酸(gly)、第309位的天冬酰胺(asn)分别突变为缬氨酸(val)、丙氨酸(ala)、色氨酸(trp)；

7、将seq id no.1所示氨基酸序列的第304位苏氨酸(thr)、第307位的甘氨酸(gly)分别突变为缬氨酸(val)和丙氨酸(ala)。

8、以上为组合突变体，而单点突变体则如下所示：

9、将seq id no.1所示氨基酸序列的第123位苯丙氨酸(phe)突变为色氨酸(trp)；或

10、将seq id no.1所示氨基酸序列的第271位天冬氨酸(asp)突变为甘氨酸(gly)；或

11、将seq id no.1所示氨基酸序列的第304位苏氨酸(thr)突变为缬氨酸(val)；或

12、将seq id no.1所示氨基酸序列的第307位的甘氨酸(gly)突变为丙氨酸(ala)；或

13、将seq id no.1所示氨基酸序列的第309位的天冬酰胺(asn)突变为酪氨酸(tyr)；或

14、将seq id no.1所示氨基酸序列的第309位的天冬酰胺(asn)突变为色氨酸(trp)；或

15、将seq id no.1所示氨基酸序列的第344位的苏氨酸(thr)突变为缬氨酸(val)；或

16、将seq id no.1所示氨基酸序列的第366位的异亮氨酸(ile)突变为缬氨酸(val)；或

17、将seq id no.1所示氨基酸序列的第381位的赖氨酸(lys)突变为精氨酸(arg)。

18、本发明的第二个目的，提供一种编码前述的糖基转移酶突变体的核苷酸分子。

19、本发明的第三个目的，提供一种包含前述的核苷酸分子的载体。

20、本发明的第四个目的，提供一种表达前述的糖基转移酶突变体的重组菌。

21、在优选的实施方案中，所述重组菌以芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母中的任意一种为宿主菌。

22、本发明的第五个目的，提供一种前述的糖基转移酶突变体、或前述的核苷酸分子、或前述的表达载体、或者前述的重组菌在红景天苷合成中的应用。

23、在优选的实施方案中，重组菌在合成体系中的浓度为20-30g·l-1。合成体系的温度为35-50℃。

24、具体地，重组菌表达l-氨基酸脱氨酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、蔗糖合酶、所述的糖基转移酶突变体，以l-酪氨酸为底物通过多酶级联合成红景天苷。

25、糖基转移酶突变体可以联合其它酶形成多酶级联催化体系，也可以单独使用(例如直接以酪醇为底物催化合成红景天苷，可以采用更高的温度40-50℃以加快反应速率)。

26、相对于现有技术，本发明首先采用计算机辅助设计的方式，筛选获得一系列热稳定性显著提高的单点突变株，随后通过对单点突变进行有序组合，获得了热稳定性进一步提高的2点至6点组合突变株，热稳定性研究结果显示最优突变体在40℃的半衰期相比于原始酶提高了133.5倍。将本发明获得的热稳定性突变体用于红景天苷的多酶合成，产量均获得了显著提高，最高达到13.8g/l，是未突变前的4.2倍。本发明成功地解决了红景天苷酶法合成过程中糖基转移酶稳定性差的关键问题，表现出非常大的工业应用前景。