一种球孢白僵菌基因工程菌及其构建方法和应用

本发明涉及生物工程，尤其涉及一种发酵高产r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的球孢白僵菌基因工程菌的构建方法及应用。

背景技术：

1、r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸作为苯氧基除草剂的中间体，在生产过程中发挥着至关重要的作用。这种除草剂可用于选择性地抑制双子叶植物的生长和发育。这种化合物的作用与植物激素类似，可刺激乙烯和脱落酸的合成，破坏植物的蛋白质合成、细胞分裂和生长。迄今为止，苯氧基除草剂因其成本低、除草效果快、杀草谱广而在生产中发挥着重要作用。

2、早先的研究报道中，球孢白僵菌是r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的主要生产者，其生产主要于胞内p450酶，目前大部分报道的p450酶为nadh辅因子依赖型。然而，辅因子nadh的价格是高昂的，外源添加nadh易导致生产成本的提高，不利用工业化生产。

3、目前，大部分提高球孢白僵菌生物膜发酵生产r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸仍停留在工艺优化阶段，在球孢白僵菌生物膜发酵工艺中，常常需要补充大量碳源和氮源用于菌株的代谢以满足发酵生产r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的需求。此外，尚未报道通过基因工程手段以球孢白僵菌提高r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。

4、因此，构建球孢白僵菌基因工程菌株用于高效发酵生产r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明目的是针对现有的球孢白僵菌生物膜发酵生产r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的过程中nadh不足的缺陷，提供一种发酵高产r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的球孢白僵菌基因工程菌及其构建方法和应用，来解决上述现有技术中球孢白僵菌生物膜发酵过程中nadh不足的问题。本发明基因工程菌适用于提高球孢白僵菌生物膜nadh生产水平，使之高效生产r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种高产r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的球孢白僵菌基因工程菌及其构建方法和应用。

4、本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

5、一种球孢白僵菌基因工程菌，所述球孢白僵菌基因工程菌是以beauveriabassiana zjb23323为底盘菌，过表达底盘菌中的proc基因、glud基因、aldh基因中的一种或多种得到。

6、beauveria bassiana zjb23323已在专利cn116590153a中公开，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no:m 2023584,保藏日期：2023年04月21日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。

7、所述proc基因、glud基因、aldh基因均来源于底盘菌。

8、优选的，过表达底盘菌中的proc基因、glud基因、aldh基因，或同时过表达glud基因和aldh基因，或同时过表达proc基因、glud基因和aldh基因。

9、更优选的，所述球孢白僵菌基因工程菌由底盘菌同时过表达proc基因、glud基因和aldh基因得到。

10、进一步，所述球孢白僵菌基因工程菌按以下方法构建得到：

11、(1)构建含有proc基因、glud基因、aldh基因中的一种或多种的表达质粒；

12、(2)将表达质粒导入底盘菌beauveria bassiana zjb23323，得到球孢白僵菌基因工程菌。

13、所述proc基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述glud基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述aldh基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

14、所述表达质粒指在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸，是在表达载体中插入proc基因、glud基因、aldh基因中的一种或多种构建得到。优选该表达质粒的表达载体为pbargpe1；所述的pbargpe1载体的核苷酸序列如seq id no.4所示。

15、所述步骤(1)中，优选表达质粒以pbargpe1为载体，分别插入proc基因、glud基因、aldh基因、glud基因和aldh基因、proc基因和glud基因和aldh基因，构建得到表达质粒pbar-proc、pbar-glud、pbar-aldh、pbar-aldh-glud、pbar-aldh-glud-proc。

16、pbar-aldh-glud可以通过以pbar-aldh为载体，插入glud基因得到。

17、pbar-aldh-glud-proc可以通过以pbar-aldh-glud为载体，插入proc基因得到。

18、本发明还提供一种球孢白僵菌基因工程菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

19、(1)构建含有proc基因、glud基因、aldh基因中的一种或多种的表达质粒；

20、(2)将表达质粒导入底盘菌beauveria bassiana zjb23323，得到球孢白僵菌基因工程菌。

21、优选的，所述步骤(1)中，构建含有proc基因、glud基因、aldh基因、glud基因和aldh基因、proc基因和glud基因和aldh基因的表达质粒。

22、更优选的，以pbargpe1为载体，分别插入proc基因、glud基因、aldh基因、glud基因和aldh基因、proc基因和glud基因和aldh基因，构建得到表达质粒pbar-proc、pbar-glud、pbar-aldh、pbar-aldh-glud、pbar-aldh-glud-proc。

23、proc基因、glud基因、aldh基因是以beauveria bassiana zjb23323为底盘菌，通过pcr扩增得到。

24、所述步骤(2)中，优选按以下步骤进行：

25、制备底盘菌的芽生孢子感受态细胞；将表达质粒导入芽生孢子感受态细胞中进行转化，得到球孢白僵菌基因工程菌。

26、进一步，将表达质粒pbar-proc、pbar-glud、pbar-aldh、pbar-aldh-glud、pbar-aldh-glud-proc导入芽生孢子感受态细胞中进行转化，分别得到工程菌菌株bbzjb23323-proc*、bbzjb23323-glud*、bbzjb23323-aldh*、bbzjb23323-aldh-glud*、bbzjb23323-aldh-glud-proc*。

27、本发明在底盘菌beauveria bassiana zjb23323的基础上，综合运用系统代谢工程策略，借助调节元件来优化beauveria bassiana zjb23323生物体内l-脯氨酸代谢途径(proc基因)、谷氨酸循环途径(glud基因)、丙酮酸降解途径(aldh基因)中nadh合成基因的表达水平，进一步提高nadh合成水平，增加生物膜发酵过程中r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的产量，最终得到生物膜发酵高产r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的球孢白僵菌基因工程菌。

28、第二方面，本发明提供了所述球孢白僵菌基因工程菌在生物膜发酵生产r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸中的应用。

29、进一步，优选所述应用的方法为：

30、球孢白僵菌基因工程菌接种至发酵培养基或含固定化载体的发酵培养基中，发酵培养基中含有底物r-2-苯氧基丙酸，在28～35℃、ph 6～7条件下进行发酵培养11～15天，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。

31、优选在28℃、ph 6.8条件培养11～15天。

32、进一步，所述发酵培养基浓度组成为：r-2-苯氧基丙酸30～50g/l，葡萄糖20～40g/l，酵母提取物5～10g/l，mgso40.5～1g/l，cacl20.5～1g/l，k2hpo41～2g/l，kh2po40.5～1g/l，微量元素溶液30～50ml/l，溶剂为水，ph 6～7；所述微量元素溶液包括以下组分：edta-2na·2h2o 1～2g/l，feso4·7h2o 0.5～0.6g/l，znso4·7h2o 0.1～0.2g/l，mnso4·h2o 0.1～0.2g/l，nicl2·6h2o 0.01～0.04g/l，cocl20.01～0.02g/l，h3bo30.01～0.03g/l，na2moo4·h2o 0.001～0.01g/l，溶剂为水，ph 6～8。

33、优选所述发酵培养基浓度组成为：r-2-苯氧基丙酸50g/l，葡萄糖40g/l，酵母提取物10g/l，mgso40.977 g/l，cacl20.755 g/l，k2hpo41.8 g/l，kh2po40.75 g/l，微量元素溶液50ml/l，溶剂为水，ph 6.8；所述微量元素溶液包括以下组分：edta-2na·2h2o 2g/l，feso4·7h2o 0.6g/l，znso4·7h2o0.2g/l，mnso4·h2o 0.15g/l，nicl2·6h2o 0.04g/l，cocl20.02 g/l，h3bo30.03g/l，na2moo4·h2o 0.005g/l，溶剂为水，ph 6.8。

34、进一步，在发酵培养的第3天，第5天，第7天，第9天分别补充10％(v/v)的600g/l无菌葡萄糖溶液。

35、进一步，在发酵培养的第3天，第5天分别补充5％(v/v)的200g/l无菌酵母提取物溶液。

36、进一步，所述基因工程菌接种至发酵培养基前，先进行种子培养，得到的种子液以体积浓度10％的接种量接种至发酵培养基。

37、优选的，将基因工程菌的分生孢子接种至含有20ml的发酵培养基进行种子培养，28℃，200rpm条件下浸没培养72小时进行菌株富集，随后以10％的接种量转移至新鲜的发酵培养基或含固定载体的发酵培养基中进行发酵培养。

38、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

39、本发明运用基因编辑技术，在现有工程菌的基础上进一步强化球孢白僵菌生物膜发酵高产r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸发酵过程中辅因子nadh合成相关酶的表达水平，提高球孢白僵菌生物膜发酵高产r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸发酵的产量。本发明相比出发菌株，所有工程菌株的r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸发酵周期缩短，产量得到了明显提升，避免了昂贵辅因子nadh的外源添加，适合于大规模工业化生产应用，有很大的推广应用的价值。