提取和纯化组织外泌体的试剂盒及提取纯化外泌体的方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及提取和纯化组织外泌体的试剂盒及提取纯化外泌体的方法。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicles，ev)是一种由不同类型的细胞释放到细胞外基质的膜性小囊泡，其功能是参与细胞间的分子运输,几乎存在于所有主要体液中。ev内含有不同类型的分子，包括蛋白质、脂类、dna、mrna、mirna等，这些内容物质会随着亲代细胞分泌ev时的状态和所处环境的改变而发生改变，即ev携带的内容物质信息代表了ev分泌之初亲代细胞的细胞状态。ev的大小从30nm到1000nm不等，可根据其生物发生、大小和生物物理性质进一步分类。对ev的经典描述依据的是囊泡大小，当直径＜150nm时ev可被定义为外泌体。

2、现如今外泌体的分离和纯化一直是科研工作者关注的问题，如何获得高纯度的外泌体以及在提取外泌体的过程中保持外泌体结构的完整性对于后续的研究至关重要。目前科研人员多采用超速离心、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离，但目前组织样本外泌体的提取和纯化的难度较大，目前常用方法是将组织酶解后结合差速离心法、密度梯度离心法收集外泌体。差速离心法较为成熟但难以保证差速离心后外泌体的结构完整性，而密度梯度离心法操作复杂，且外泌体的得率较低，不适用于大多数科研人员操作，因此如何提高外泌体纯度并且保持外泌体结构的完整性，且还能保持高的得率是外泌体提取的关键。

3、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供了提取和纯化组织外泌体的试剂盒，该试剂盒通过采用沉淀试剂从而代替超速离心的方式实现对外泌体的沉淀提取，而后采用sec沉淀试剂实现外泌体的纯化，使得所得外泌体纯度和得率更高，并且能够保持外泌体结构的完整性。

2、本发明的第二目的在于提供了提取纯化组织外泌体的方法，该方法能够实现外泌体的快速提取和纯化，具有方便易行且外泌体纯度高的优势。

3、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

4、本发明提供了提取和纯化组织外泌体的试剂盒，主要包括以下物质：

5、胶原酶、沉淀试剂、sec纯化载体和清洗液；

6、其中，所述沉淀试剂为聚乙二醇和pbs的混合；

7、优选地，所述聚乙二醇和pbs的质量比为(1-2)：(2-4)。

8、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述聚乙二醇和pbs的质量比为1:2。

9、目前在外泌体的提取和纯化中，大多是将组织样本进行酶解后结合差速离心法、密度梯度离心法从而实现外泌体的收集，但由于差速离心法较难保证离心后的外泌体的结构完整性，从而使得所得到的外泌体在一定程度下会失去活性；而密度梯度离心法收集外泌体的操作复杂，且外泌体的得率不高。但在外泌体的应用中，本发明已经发现组织外泌体可以用于疾病标志物的筛选，如通过蛋白质谱技术可以特异性寻找肺相关疾病蛋白标志物，通过基因芯片和测序技术可以特异性的寻找肺相关疾病的核酸标志物，因为本发明设计了一种可以实现组织外泌体的快速提取和纯化的试剂盒，避免通过离心的方式去提取外泌体，从而保证外泌体结构的完整性并且能够实现较高的得率。

10、在上述试剂盒中，本发明通过采用沉淀试剂从而实现组织外泌体的富集，其中沉淀试剂为聚乙二醇和pbs的混合。本发明所选用的聚乙二醇具有能够沉淀捕捉外泌体的作用，能够实现组织样本酶解后所得到的外泌体进行沉淀和富集，而pbs的添加能够使得聚乙二醇能够充分溶解，从而能对酶解后的组织样本进行充分的沉淀，提取到得率更高的外泌体，因此可以知道，对于本发明而言，沉淀试剂中聚乙二醇和pbs缺一不可，只有当pbs与聚乙二醇同时存在作为沉淀试剂时，其才能对酶解后的组织样本进行外泌体的捕捉和沉淀，若不使用pbs对聚乙二醇进行充分溶解，则会使得沉淀试剂中的所存在的聚乙二醇含量较低，则其对于组织外泌体的沉淀效果也会相应的受到影响，因而会使得外泌体得率较低或者外泌体无法被沉淀和捕捉；若不使用聚乙二醇而仅仅使用pbs对外泌体进行沉淀时，经过酶解后的组织样本所释放的组织外泌体并不能被沉淀和捕捉，因此可以知道，虽然聚乙二醇其具有捕捉和沉淀外泌体的效果，但其分子量的选择和psb的质量比对于本发明而言是非常重要的，更好的是当沉淀试剂中聚乙二醇和pbs的质量比为(1-2)：(2-4)时，并且当聚乙二醇和pbs的质量比为1:1时，通过试剂盒提取和纯化后的外泌体得率是最高的，结构完整，纯度也是最高的。这是因为聚乙二醇的添加对于最终外泌体的得率是息息相关的，如果聚乙二醇添加过少时，通过酶解后的组织样本中的外泌体不能够被充分捕捉，从而影响得率，而其中pbs的添加则能够保证外泌体的稳定，使得其结构能够保持完整，若pbs添加过少，则会使得聚乙二醇无法充分溶解，使其对于外泌体的沉淀和捕捉效果受到影响。

11、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述聚乙二醇分子量为2000-10000；

12、优选地，所述聚乙二醇分子量为8000。

13、在上述原料中，由于沉淀试剂中的聚乙二醇能够实现外泌体的沉淀和捕捉，因此其分子量的选择对于本发明而言是非常重要的，其分子量处于2000-10000的范围时，优选地是当聚乙二醇的分子量为8000，其所通过沉淀捕捉后得到的外泌体得率是较高的，若聚乙二醇的分子量过小，则会使得外泌体无法沉淀和捕捉，若分子量太大则会使得外泌体的得率下降。

14、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述sec纯化载体为葡聚糖或琼脂糖。

15、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述sec纯化载体的颗粒粒径为30nm-70nm。

16、在上述原料中，本发明在通过沉淀试剂对已经经过酶解后组织样本进行外泌体的沉淀和捕捉，但此时经过沉淀试剂后所得到的外泌体中存在着其他蛋白，因此为了实现组织外泌体的纯化，本发明通过采用sec方案从而实现外泌体的纯化，其中sec为基于sec纯化载体琼脂糖或葡聚糖填料的尺寸排阻分离柱，其中通过沉淀试剂沉淀和捕捉过后所得到的外泌体会通过填充的sec纯化载体的颗粒间隙，而杂质蛋白则会进入颗粒的孔隙从而进行非特异性蛋白的吸附，实现外泌体的纯化，其中对于sec纯化载体的颗粒粒径本发明也是有限定的，其中当sec纯化载体的颗粒粒径为30nm-70nm时，其对于外泌体所达到的纯化效果最好，能使得外泌体的纯度更高，颗粒粒径过小，则会使得部分大颗粒蛋白质无法进入颗粒孔隙，和外泌体同时通过间隙获得，影响外泌体的纯度与得率；若颗粒粒径过大则会使得部分外泌体也进入了颗粒的孔隙，使得外泌体的得率降低。

17、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述胶原酶为i型胶原酶、ii型胶原酶、iii型胶原酶和iv胶原酶型中的一种或多种。

18、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述胶原酶为i型胶原酶、ii型胶原酶、iii型胶原酶和iv型胶原酶的混合。

19、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述胶原酶的浓度为0.5mg/ml-2mg/ml。

20、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述胶原酶中i型胶原酶、ii型胶原酶、iii型胶原酶和iv型胶原酶的体积比为1：1：(1-2)：(1-2)；

21、优选地，作为进一步具体的实施方式，优选地，所述i型胶原酶、ii型胶原酶、iii型胶原酶和iv型胶原酶的体积比为1:1:1:1。

22、为了使得所得到的外泌体得率的纯度尽可能高，本发明通过采用i型胶原酶、ii型胶原酶、iii型胶原酶和iv型胶原酶的混合的方式从而对组织样本进行酶解，使得复合型胶原酶对于组织样本的酶解更加充分，组织间隙外泌体的释放也更加充分，从而使得在后续的富集中得到更多的外泌体，其中复合型胶原酶的浓度是处于0.5mg/ml-2mg/ml之间的，并且在复合型胶原酶的组成中，各个胶原酶之间也是有一定的体积比的，其中当胶原酶中i型胶原酶、ii型胶原酶、iii型胶原酶和iv型胶原酶的体积比为1：1：(1-2)：(1-2)；更好的i型胶原酶、ii型胶原酶、iii型胶原酶和iv型胶原酶的体积比为1:1:1:1时，其对于组织样本的酶解效果较好，可以实现组织间隙外泌体的充分释放，其中若是复合型胶原酶的浓度过低，则会使得组织样本的酶解程度不充分，影响后续对于外泌体的得率，若是复合型胶原酶的浓度过高，则会对外泌体蛋白造成一定的消耗，从而影响外泌体的得率。

23、本发明还提供了上述试剂盒进行提取纯化外泌体的方法，包括以下步骤：

24、用胶原酶对组织样本进行酶解，得到组织间隙外泌体；

25、通过沉淀试剂对组织间隙外泌体进行富集，而后利用sec纯化载体对富集后的组织间隙外泌体进行纯化，即得组织外泌体。

26、上述方法中，适用于本发明的组织样本包括肝组织、脑组织、肺组织、胃组织等，优选的组织是肿瘤组织。

27、在上述制备方法，本发明通过采用胶原酶对组织样本进行酶解，对组织样本中的组织间隙外泌体的释放，通过对组织样本采用胶原酶进行充分的酶解，而后再通过沉淀试剂将酶解过后的组织样本进行外泌体的沉淀和捕捉，从而实现外泌体的快速提取，避免通过超速离心的方式从而获取外泌体，可以使得外泌体的结构保持完整，而后将通过富集的外泌体通过sec方案实现外泌体的纯化，使外泌体通过sec尺寸分离排阻柱内填充的sec纯化载体，其中所含有的非特异性蛋白被阻拦在分离排阻柱中，而外泌体则由于分离排阻柱实现了与非特异性蛋白的分离，实现了最终外泌体的纯化，使得最终所得到的外泌体纯度更高，因此通过本发明的方法所获得的组织外泌体与通过其它外泌体分离技术所获得的总外泌体纯度和得率更高，外泌体结构完整，能够实现外泌体的快速提取和纯化。

28、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

29、(1)本发明提供了提取和纯化组织外泌体的试剂盒，该试剂盒通过采用沉淀试剂从而代替超速离心的方式实现对外泌体的沉淀提取，而后采用sec沉淀试剂实现外泌体的纯化，使得所得外泌体纯度和得率更高，并且能够保持外泌体结构的完整性。

30、(2)本发明提供了提取纯化组织外泌体的方法，该方法能够实现外泌体的快速提取和纯化，具有方便易行且外泌体纯度高的优势。