鉴定生物体中外源导入片段是否缩短的方法及其应用与流程

本发明属于分子生物学，涉及一种鉴定生物体中外源导入片段是否缩短的方法及其应用。

背景技术：

1、野生近缘种和不同栽培类型的种质资源中含有很多用于主栽品种改良的优异等位基因，发掘并有效利用这些优异等位基因，如抗病基因，有利于拓宽栽培品种的抗病能力，成为当前改良品种抗性最主要的手段之一。但野生近缘种和不同栽培类型的种质资源中往往同时存在许多对主栽品种农艺、品质或者风格特色性状不利的基因，在杂交和回交的过程中，如果不利基因和要转移的目标基因紧密连锁，会出现连锁累赘，增加优异基因利用的难度。

2、烟草斑萎病(tobacco spotted wilt disease,tswd)是由正番茄斑萎病毒属病毒(orthotospoviruses)侵染所造成的严重病害。番茄斑萎病毒(tomato spotted wiltvirus，tswv)是正番茄斑萎病毒属的代表种。具翼烟草(nicotiana alata)是一种野生烟草，对tswv具有很好的抗性。利用耳状烟草n.otophora作为桥梁亲本，gajos等人成功地将tswv抗性位点(rtsw位点)从具翼烟草转育至栽培烟草(nicotiana tabacum l.)中，获得了包含长rtsw导入片段的抗斑萎病育种材料polalta。然而，polalta及其他包含长rtsw导入片段的栽培烟草都表现出严重的连锁累赘，例如发育迟缓、叶片畸形、植株矮化和育性降低。这些连锁累赘来源于长rtsw导入片段上与rtsw位点紧密连锁或共分离的连锁累赘基因组分，但具体的遗传关系还不清楚。

3、申请号为202111311707.0，发明名称为“用于筛选无连锁累赘的抗斑萎病烟草植物的分子标记及其应用”的中国专利申请以及申请号为pct/cn2021/129382，发明名称为“无连锁累赘的抗斑萎病烟草植物及其选育方法”的pct国际申请中，公开了其利用polalta和k326(主栽烟草品种)进行杂交和回交，通过遗传位点分析、分子标记开发及大规模筛选鉴定获得了5株无连锁累赘的抗斑萎病烟草植物，其中含有最短rtsw导入片段的烟草植物k326rtsw单株12(bc7f1世代)仅含有1.6mb的rtsw导入片段。虽然k326rtsw单株12已去除连锁累赘，但仍含有除rtsw基因以外的野生烟草基因组组分，这些组分可能对主栽烟草品种的基因表达造成扰动。因此，有必要筛选含有更短rtsw导入片段的抗斑萎病烟草，以减少野生烟草基因组组分的影响。

4、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)在基因组中分布相当广泛，是植物个体间最常见的遗传变异形式，常出现的单核苷酸多态性包括碱基的替换、颠换、插入和缺失。在基因组广泛分布的snp大部分并不直接决定表型，但由于snp与决定表型的位点紧密连锁，因此可以开发成为重要的分子标记。snp已经成为植物复杂性状遗传研究的最理想分子标记之一。

5、竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr，kasp)是通过引物末端碱基的特异匹配来对snp分型。基本原理为：针对等位基因，使用末端碱基不同且5’端分别携带fam和hex荧光接头序列的两条引物，以及含有fam和hex荧光探针的kasp预混液进行pcr，根据扩增产物所携带的不同荧光信号，可以快速对大量样本进行检测，准确判断其基因型。kasp技术通过荧光检测snp标记，具有超高的灵活性、准确度和性价比，能够实现高通量和自动化检测，在作物辅助育种应用中发挥重要作用。

6、常规的kasp主要用于基因分型检测，利用荧光信号检测仪或荧光定量pcr仪(配有相应荧光探针的检测通道)进行信号读取，然后用软件采集信号并判别等位基因类型。目前已有人用kasp筛选具有短导入片段的个体，其在导入片段的两端根据等位基因类型设计两套不同的snp检测引物并分别进行pcr扩增。该方法的操作过程较为复杂，至少需要将所有样品做两轮pcr，分别读取信号并综合导入片段两端的kasp结果来判断待测个体中导入片段是否缩短。在大规模高通量筛选时，两轮pcr耗时耗力，在操作过程中容易混淆样品而造成结果错误，同时也加大了样品被污染或者混合的风险。

7、因此，迫切需要开发一种更简便、高效和准确的鉴定短导入片段的方法，以满足高通量筛选的需求。

技术实现思路

1、本发明提供一种鉴定生物体中外源导入片段是否缩短的方法，其包括：

2、a)基于外源导入片段两端的核苷酸序列设计并合成两个引物对，其中第一引物对能够特异性扩增外源导入片段左端的特征序列，其上游引物的5’端含有第一接头序列；第二引物对能够特异性扩增外源导入片段右端的特征序列，其上游引物的5’端含有第二接头序列；并且两个引物对均不会扩增待测生物体的原基因组序列；

3、b)以含有外源导入片段的待测生物体的基因组dna为模板，使用第一引物对、第二引物对和kasp预混液进行pcr；所述kasp预混液中包含第一荧光探针、第一淬灭探针、第二荧光探针、第二淬灭探针；第一荧光探针的核苷酸序列与第一接头序列一致，并且与第一淬灭探针的核苷酸序列反向互补；第二荧光探针的核苷酸序列与第二接头序列一致，并且与第二淬灭探针的核苷酸序列反向互补；第一荧光探针的5’端标记有第一荧光基团，并且第一淬灭探针的3’端标记有相应的淬灭基团；第二荧光探针的5’端标记有第二荧光基团，并且第二淬灭探针的3’端标记有相应的淬灭基团；第一荧光基团发出的第一荧光信号不同于第二荧光基团发出的第二荧光信号；

4、c)pcr结束后，检测扩增产物的荧光信号；若同时检测到第一荧光信号和第二荧光信号，则待测生物体中的外源导入片段没有缩短；若只检测到第一荧光信号，则待测生物体中的外源导入片段的右端缩短；若只检测到第二荧光信号，则待测生物体中的外源导入片段的左端缩短；若没有检测到荧光信号，则待测生物体中的外源导入片段两端均缩短。

5、上述方法中，所述生物体可为植物、动物或微生物。

6、上述方法中，所述外源导入片段可包含用于赋予或提高所述生物体的抗病性能、生长性能或生产性能的目的基因以及除目的基因以外的冗余dna。

7、本发明还提供一种选育含有短rtsw导入片段的抗斑萎病烟草的方法，其包括：

8、a)以抗斑萎病烟草polalta为父本、栽培烟草为母本进行杂交，并以所述栽培烟草为轮回亲本进行回交，得到子代植株；

9、b)从所述子代植株中筛选具有斑萎病抗性的植株作为候选单株，然后从所述候选单株中筛选不含有第一分子标记和/或第二分子标记的植株，即得到含有短rtsw导入片段的抗斑萎病烟草；

10、其中第一分子标记和第二分子标记的检测方法包括：以所述候选单株的基因组dna为模板，使用第一引物对、第二引物对和kasp预混液进行pcr；所述第一引物对的核苷酸序列如seq id no.5和6所示；所述第二引物对的核苷酸序列如seq id no.7和8所示；

11、所述kasp预混液中包含第一荧光探针、第一淬灭探针、第二荧光探针、第二淬灭探针；第一荧光探针的核苷酸序列与seq id no.5所示的第1-21位核苷酸序列一致，并且与第一淬灭探针的核苷酸序列反向互补；第二荧光探针的核苷酸序列与seq id no.7所示的第1-21位核苷酸序列一致，并且与第二淬灭探针的核苷酸序列反向互补；第一荧光探针的5’端标记有第一荧光基团，并且第一淬灭探针的3’端标记有相应的淬灭基团；第二荧光探针的5’端标记有第二荧光基团，并且第二淬灭探针的3’端标记有相应的淬灭基团；第一荧光基团发出的第一荧光信号不同于第二荧光基团发出的第二荧光信号；

12、pcr结束后，检测扩增产物的荧光信号；只检测到第一荧光信号或只检测到第二荧光信号或没有检测到荧光信号的植株不含有第一分子标记和/或第二分子标记。

13、上述方法中，所述第一荧光基团可为fam，并且所述第二荧光基团可为hex。

14、上述方法中，所述回交为任意世代回交。

15、上述方法中，所述栽培烟草为拉丁名为nicotiana tabacum中的任意一种栽培型烟草品种或品系。

16、本发明还提供用于筛选含有短rtsw导入片段的抗斑萎病烟草的引物组，其包括核苷酸序列如seq id no.5和6所示的第一引物对和核苷酸序列如seq id no.7和8所示的第二引物对。

17、本发明还提供一种试剂盒，其包含所述的用于筛选含有短rtsw导入片段的抗斑萎病烟草的引物组。

18、上述试剂盒还可包含用于kasp的通用试剂。

19、通过研究kasp标记的特性，我们开发了上述鉴定生物体中外源导入片段是否缩短的方法。该方法是一种改进的kasp分型方法，通过在外源导入片段的两端设计含有不同荧光标记的引物对，只需进行一轮pcr即可鉴定待测生物体是否具有缩短的外源导入片段。如果导入片段没有缩短，则两端的引物对均具有扩增，扩增产物会产生两种荧光；如果导入片段的一端缩短，则这一端的引物对失去模板而不能扩增，只能检测到另一端的引物对扩增产生的荧光；如果导入片段的两端缩短，则两端的引物对均失去模板而不能扩增，没有荧光产生。

20、基于上述改进的kasp分型方法，我们开发了用于筛选含有短rtsw导入片段的抗斑萎病烟草的scar-kasp引物组。该引物组由核苷酸序列如seq id no.5和6所示的第一引物对和核苷酸序列如seq id no.7和8所示的第二引物对组成。其中第一引物对位于rtsw导入片段的左端，第二引物对位于rtsw导入片段的右端。利用该引物组对本课题组获得的抗斑萎病烟草bc8f1回交群体进行筛选，获得了5株含有短rtsw导入片段的抗斑萎病烟草。由此可见，本发明改进的kasp分型方法能够有效筛选含有短rtsw导入片段的抗斑萎病烟草，在烟草分子育种中，特别是含有外源导入片段的交换单株筛选，去除外源导入片段带来的连锁累赘中具有良好的应用前景。

21、与以往的传统标记筛选相比，本发明改进的kasp分型方法具有准确性高、成本低廉、检测效率高等优点，适用于大规模育种筛查。该方法具有通用性，可用于任何植物育种中导入片段缩短植株的高通量筛选。利用该方法可以在早世代进行苗期筛选，极大地缩短定向改良的育种周期，提高育种效率。

22、除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。为使本发明更容易理解，下面对部分术语进行解释。

23、rtsw基因是指具翼烟草(nicotiana alata)基因组中使具翼烟草具有抗烟草斑萎病性状的基因。含有rtsw基因的烟草植株具有斑萎病抗性。

24、rtsw位点、tswv抗性位点或抗斑萎病基因位点是指具翼烟草基因组中包含rtsw基因的dna片段，该位点在杂合或者纯合状态下都赋予烟草植株抗烟草斑萎病性状。

25、rtsw导入片段是指包含rtsw基因的具翼烟草的dna片段。含有rtsw导入片段的烟草植株具有抗烟草斑萎病性状。短rtsw导入片段是指长rtsw导入片段上与rtsw基因连锁的非rtsw基因组分部分或全部缺失，并保留完整rtsw基因功能的dna片段。导入是指将遗传基因座的所需等位基因从一个遗传背景传递到另一个遗传背景。

26、回交是子一代和两个亲本的任意一个进行杂交的一种方法。被用来回交的亲本称为轮回亲本。两个亲本初始杂交产生f1代。bc1是指第二次使用轮回亲本，bc2是指第三次使用轮回亲本，以此类推。