一种基于线粒体基因组DNA探针捕获高通量测序的细胞种属污染鉴定方法与流程

本发明涉及生物，特别涉及一种基于线粒体基因组dna探针捕获高通量测序的细胞种属污染鉴定方法。

背景技术：

1、确保用于生产用（重组蛋白、疫苗等生物制品生产）细胞基质、治疗性细胞产品，在体外培养过程中无不同种属间细胞交叉污染，是细胞质量控制中的重要内容之一，近年来国内干细胞及组织工程细胞在基础研究及临床应用研究中快速发展，进一步强调了对细胞间交叉污染检测的重要性。目前《中国药典》2010年版对于细胞种属鉴定及排除细胞间交叉污染的方法，主要是采用染色体分析、str图谱和同工酶图谱分析法。这些方法主要的缺点是耗时、成本高，或是细胞用量大，以及可检定的种属范围窄。其中除str图谱检测外，所有其他方法灵敏度都很低，而成熟的str方法只适合对人源细胞的检测。

2、多种基于蛋白和dna的方法可以用于动物物种鉴定，这些方法在实用性和所具有优势方面存在差异，也各有局限。国标gb/t 40172-2021《哺乳动物细胞交叉污染检测方法通用指南》文件中对常用检测方法的原理、依据、局限和结果判读有原则性的描述。

3、

4、线粒体dna（mtdna）在不同物种间具有高度保守性，但也存在足够的变异来区分物种。这使得mtdna成为物种鉴定的理想工具。线粒体中用来物种鉴定的基因主要有细胞色素c氧化酶亚基i（coi）基因，细胞色素b（cytb）基因，12s和16s核糖体rna（rrna）基因，nd（nadh脱氢酶）基因群（nd1、nd2、nd3），atp合成酶亚基6（atpase 6）和atp合成酶亚基8（atpase 8）基因。目前主要通过pcr扩增和测序，通过比较这些基因的序列，可以确定样本的物种身份。在物种鉴定中，通常会结合多个基因的序列信息来提高鉴定的准确性。然而，上述方法往往需要设计多对引物进行多轮扩增，从而一次检测往往需要消耗大量实验和人工成本。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种基于线粒体基因组dna探针捕获高通量测序的细胞种属污染鉴定方法，其主要基于线粒体序列在不同种属间的保守性，利用人线粒体探针捕获未知物种的线粒体序列，根据不同物种线粒体基因组的覆盖度进行物种鉴定，这种方法理论上可以对大部分物种进行鉴定，提升了种属间物种鉴定效率。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了鉴定细胞种属污染的方法，所述细胞种属污染特定物种的细胞的交叉污染，所述特定物种的细胞包括vero、cho和/或sf9，该方法基于人线粒体探针捕获待测培养物的核酸片段进行测序分析获得细胞种属污染鉴定结果。

4、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法包括如下步骤：

5、步骤（a1）：采用人线粒体探针捕获待测培养物的核酸片段，测序，获得与人线粒体序列同源的同源序列；

6、步骤（a2）：将所述同源序列与所述特定物种的线粒体的核苷酸序列进行比对，获得覆盖度，根据所述覆盖度获得鉴定结果。

7、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述覆盖度为87%以上的判为存在所述特定物种的细胞；所述覆盖度为6%以下的判为不存在所述特定物种的细胞。

8、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述特定细胞不包括非污染细胞，若一个以上物种所述覆盖度为87%以上，判为存在所述特定物种的细胞，即存在细胞种属污染或细胞交叉污染。

9、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述特定细胞不包括非污染细胞，若一个以上物种所述覆盖度为87%以上，其余物种覆盖度为6%以下，判为存在所述特定物种的细胞，即存在细胞种属污染或细胞交叉污染。

10、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述特定细胞包括非污染细胞，若两个以上物种所述覆盖度为87%以上，判为存在所述特定物种的细胞，即存在细胞种属污染或细胞交叉污染。

11、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述特定细胞包括非污染细胞，若两个以上物种所述覆盖度为87%以上，其余物种覆盖度为6%以下，判为存在所述特定物种的细胞，即存在细胞种属污染或细胞交叉污染。

12、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述的特定物种的线粒体的核苷酸序列与人线粒体的核苷酸序列的一致性为69%~80%。

13、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法包括如下步骤：

14、步骤（b1）：采用人线粒体探针捕获待测培养物的核酸片段，测序，获得线粒体的保守基因序列；

15、步骤（b2）：将所述保守基因序列与所述特定物种的线粒体的保守基因进行比对，获得覆盖度，根据所述覆盖度获得鉴定结果。

16、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述覆盖度为94%以上的判为存在所述特定物种的细胞。

17、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述同一个所述特定物种的多个所述覆盖度为94%以上的判为存在所述特定物种的细胞。

18、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述特定细胞不包括非污染细胞，若所述覆盖度为94%以上的判为存在所述特定物种的细胞，即存在细胞种属污染或细胞交叉污染。

19、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述特定细胞不包括非污染细胞，同一个所述特定物种的多个所述覆盖度为94%以上的判为存在所述特定物种的细胞，即存在细胞种属污染或细胞交叉污染。

20、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述特定细胞包括非污染细胞，所述覆盖度为94%以上的判为存在所述特定物种的细胞，若所述细胞存在多于一种所述特定物种，即存在细胞种属污染或细胞交叉污染。

21、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述特定细胞包括非污染细胞，同一个所述特定物种的多个所述覆盖度为94%以上的判为存在所述特定物种的细胞，若所述细胞存在多于一种所述特定物种的，即存在细胞种属污染或细胞交叉污染。

22、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述的特定物种的线粒体的保守基因与人线粒体对应的保守基因的一致性为67%以上。

23、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述的保守基因为atp6和/或cox1。

24、本发明还提供了atp6和/或cox1在鉴定细胞种属污染中的应用。

25、在本发明的一些具体实施方案中，上述应用所述细胞的包括vero、cho和/或sf9。

26、本发明的细胞种属污染鉴定方法有如下效果：

27、1. 现有技术中还未存在基于人线粒体探针捕获其它物种线粒体序列进行物种鉴定的方法，不同物种之间的线粒体序列之间存在同源性，因此其它物种的线粒体序列可以被人线粒体探针捕获；

28、2. 本发明基于线粒体度盖度进行物种鉴定，该方法检出只要获取物种的线粒体序列就可以进行鉴定。

技术特征：

1.鉴定细胞种属污染的方法，所述细胞种属污染为特定物种的细胞的交叉污染，所述特定物种的细胞包括vero、cho和/或sf9，其特征在于，基于人线粒体探针捕获待测培养物的核酸片段进行测序分析获得细胞种属污染鉴定结果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述覆盖度为87%以上的判为存在所述特定物种的细胞；所述覆盖度为6%以下的判为不存在所述特定物种的细胞。

4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述特定物种的线粒体的核苷酸序列与人线粒体的核苷酸序列的一致性为69%~80%。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述覆盖度为94%以上的判为存在所述特定物种的细胞。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述特定物种的线粒体的保守基因与人线粒体对应的保守基因的一致性为67%以上。

8.如权利要求5至7任一项所述的方法，其特征在于，所述保守基因为atp6和/或cox1。

9.atp6和/或cox1在鉴定细胞种属污染中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细胞包括vero、cho和/或sf9。

技术总结本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于线粒体基因组DNA探针捕获高通量测序的细胞种属污染鉴定方法。本发明提供了评估人线粒体探针应用于细胞种属污染鉴定的可行性的方法、细胞种属污染鉴定方法、ATP6和/或COX1在鉴定细胞种属污染中的应用，主要基于线粒体序列在不同种属间的保守性，利用人线粒体探针捕获未知物种的线粒体序列，根据不同物种线粒体基因组的覆盖度进行物种鉴定，这种方法理论上可以对大部分物种进行鉴定，提升了种属间物种鉴定效率。技术研发人员：刘青山,刘静,王佳,左宁受保护的技术使用者：赛福解码（北京）基因科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/2