与三七中三七皂苷R1含量相关的SNP9-188989821分子标记及应用

本发明属于分子遗传育种，特别涉及一种与三七中三七皂苷r1含量相关的snp分子标记及应用。

背景技术：

1、三七是人参属五加科多年生草本植物，以根及根茎入药，具有散瘀止血、消肿定痛的功效，是我国特有的名贵中药材之一。三七临床应用日益广泛，是血塞通软胶囊、云南白药、复方丹参片、复方丹参滴丸、漳州片仔癀等中成药的主要原料之一。三七皂苷是三七中最主要的活性成分，皂苷含量及种类是三七品质评价的重要指标之一。

2、品质育种是良种选育的核心举措。研究表明挖掘控制重要农艺性状关键基因的优异等位变异，通过开发等位基因特异性分子标记，可有效利用于分子标记辅助选择育种。三七品种选育主要采用集团混合选择法，主要依赖表型选择，获得群体品种，是现阶段三七品种选育的主要育种方式。但是，三七每个世代至少需要3年，表型分离和群体构建的速度都极其缓慢，也缺乏早期选择与鉴定手段，导致育种周期长、效率低，培育一个新品种需要15～20年。同时，三七为常异花授粉植物，至今没有纯系育种材料，严重限制了杂交育种方法在三七品种选育上的应用。远缘杂交也很难以用于三七种质改良。

3、随着组学技术的发展，基于分子标记开展药用植物的分子遗传育种可大大提升育种效率，并为定向提升药用植物有效成分的分子设计育种成为可能。snp标记(singlenucleotide polymorphism)主要指基因组水平上有单个核苷酸变异引起的dna序列多态变化，是当今多态覆盖率最高，密度最高的分子标记。相比于传统的分子标记辅助选择，高通量重测序技术可产生大规模的snp标记，推动标记与性状的精确关联分析，提升分子辅助选择育种的效率。三七中皂苷的含量和种类应是三七品种选育的核心目标。因此，利用已知皂苷生物合成基因和丰富的三七种质资源材料，挖掘与三七中三七皂苷含量显著关联的snp，开发出用于辅助育种的kasp分子标记，实现目标性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率显得尤为重要。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的是提供一种与三七中三七皂苷r1含量相关的snp分子标记及应用。

2、为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、本发明提供了一种检测与三七中三七皂苷r1含量相关的snp分子标记的试剂盒在三七中三七皂苷r1含量性状育种中的应用，所述的snp分子标记为snp9-188989821，位于chr5染色体第188989821位碱基，其突变类型为c/g。

4、优选的，所述snp9-188989821中，gg基因型的三七皂苷r1含量高于cc/cg基因型。

5、本发明还提供了一种用于检测与三七中三七皂苷r1含量相关的snp分子标记的kasp引物对在三七中三七皂苷r1含量性状育种中的应用，所述kasp引物包括用于检测所述snp9-188989821的上游引物snp9-f1、上游引物snp9-f2和下游引物snp9-r。

6、优选的，

7、所述snp9-f1:5’-gaaggtgaccaagttcatgcttttcccaatcacatctttttgtcc-3’；

8、所述snp9-f2:5’-gaaggtcggagtcaacggatttttcccaatcacatctttttgtcg-3’；

9、所述snp9-r:5’-tttttgtttgggcaaatgaacaga-3’。

10、本发明还提供了一种检测三七中三七皂苷r1含量高低的方法，包括如下步骤：

11、(1)提取待测三七样品的dna作为模板；

12、(2)利用权利要求3或4中所述的kasp引物对模板进行pcr扩增；

13、(3)通过高通量基因分型系统genematrix，pcr扩增完成后读取荧光信号，解析转换荧光信号，对待鉴定三七三七皂苷r1含量样本snp9-188989821分子标记位点进行基因分型；

14、(4)步骤(3)中判断待鉴定三七三七皂苷r1含量性状表型的方法如下若鉴定的基因型为gg，则判断三七样品中三七皂苷r1含量高；若鉴定的基因型为cc/cg，则判断三七样品中三七皂苷r1含量低。

15、优选的，所述pcr扩增的程序为：95℃预变性10min；95℃变性20sec；61～55℃退火40sec，每一个循环降低0.6℃，10个循环；95℃变性20sec，55℃退火40sec，35个循环。

16、优选的，所述pcr扩增的体系为：15ng/μl的dna模板1μl；2×kasp master mix 1μl；kasp混合引物0.01μl，其中上游引物snp9-f1、上游引物snp9-f2和下游引物snp9-r的体积比为1:1:3。

17、本发明具有以下有益效果：

18、本发明提供的与三七中三七皂苷r1含量显著关联的snp，是通过236份三七自然群体来进行关联分析，利用snp位点作为基因型数据，使用三七皂苷r1含量作为其表型数据，用emmax软件，采用混合线性模型(mixed linear model,mlm)进行全基因组关联(gwas)分析筛选获得。snp分子标记snp9-188989821，位于chr5染色体第188989821位碱基，为三七中三七皂苷r1含量性状的分子标记辅助育种提供技术支持。

19、本发明开发的kasp引物组合能直接对snp9-188989821的突变位点c或g碱基进行特异的区分和检测。利用该kasp引物组合对三七皂苷r1含量高低进行鉴定时，能够清楚地将两种基因型分开，分子标记snp9-188989821中，靠近y轴的圆点为携带gg等位变异位点，基因型为gg，该基因型三七的三七皂苷r1含量相对较高；靠近x轴的圆点为携带cc等位变异位点，基因型为cc，该基因型三七的三七皂苷r1含量相对较低；本发明开发的kasp引物组合具有良好的应用价值，可实现对三七的三七皂苷r1含量性状的预先选择和分子辅助育种，对于三七的三七皂苷r1含量育种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。

技术特征：

1.检测与三七中三七皂苷r1含量相关的snp分子标记的试剂盒在三七中三七皂苷r1含量性状育种中的应用，其特征在于：所述的snp分子标记为snp9-188989821，位于chr5染色体第188989821位碱基，其突变类型为c/g。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述snp9-188989821中，gg基因型的三七皂苷r1含量高于cc/cg基因型。

3.用于检测与三七中三七皂苷r1含量相关的snp分子标记的kasp引物对在三七中三七皂苷r1含量性状育种中的应用，其特征在于：所述kasp引物包括用于检测所述snp9-188989821的上游引物snp9-f1、上游引物snp9-f2和下游引物snp9-r。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，

5.一种检测三七中三七皂苷r1含量高低的方法，其特征在于：包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的程序为：95℃预变性10min；95℃变性20sec；61～55℃退火40sec，每一个循环降低0.6℃，10个循环；95℃变性20sec，55℃退火40sec，35个循环。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的体系为：15ng/μl的dna模板1μl；2×kasp master mix 1μl；kasp混合引物0.01μl，其中上游引物snp9-f1、上游引物snp9-f2和下游引物snp9-r的体积比为1:1:3。

技术总结本发明公开了一种检测与三七中三七皂苷R1含量相关的SNP分子标记的试剂盒在三七中三七皂苷R1含量性状育种中的应用，所述的SNP分子标记为SNP9‑188989821，位于Chr5染色体第188989821位碱基，其突变类型为C/G。本发明开发的KASP引物组合能准确区分三七皂苷R1含量高和低的三七，且能应用于三七分子辅助标记育种，缩短新品种培育周期，且检测成本较低、不受环境限制、检测结果准确性高、易重复。对于加快高三七皂苷R1含量三七育种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。技术研发人员：刘冠泽,李葵秀,杨生超,卢迎春,张广辉,赵艳,范伟,陈军文,李满桥受保护的技术使用者：云南农业大学技术研发日：技术公布日：2024/9/2