与烟草主流烟气中总粒相物释放量基因qTPM紧密连锁的共显性SSR标记及应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种与烟草主流烟气中总粒相物释放量基因qtpm紧密连锁的共显性ssr标记及应用。

背景技术：

1、烟草是一种叶用型经济作物，因其含有烟民吸食时可获得极大满足感和愉悦感的烟碱而被广泛种植。然而，吸烟有害健康又使烟草成为一种备受争议的经济作物。故此，培育低危害的烟草品种就成为烟草新品种选育的一个重要方向(王元英，周健.中美主要烟草品种亲源分析与烟草育种.中国烟草学报，1995，3(2)：11-22)。烟草主流烟气中的有害成分释放量是评判低危害烟草品种选育成败的核心依据(谢剑平，刘惠民，朱茂祥，等.卷烟烟气危害性指数研究.烟草科技，2009，2：5-15)。研究表明，烟草尤其是成品卷烟烟气是一种极其复杂的混合物，是在卷烟抽吸过程中由烟草燃烧、裂解和蒸馏而产生的(王珂清，秦艳华，吴洋，等.加热卷烟烟气中氨释放特性研究.中国烟草科学，2021，42(6)：74-78；赵云川，廖晓祥，陈冉，等.微波膨胀梗丝对卷烟7种烟气有害成分释放量及危害性指数的影响.烟草科技，2015，48(11)：53-58；闫宁，刘加红，杜咏梅，等.我国不同产区烤烟烟叶主流烟气主要有害成分分析.中国烟草科学，2017，38(1)：85-90；夏国聪，马丽娜，黄红仪，等.国内外不同品牌卷烟样品危害性指数比较[j].烟草科技，2012，3：37-40)。谢剑平等(谢剑平，刘惠民，朱茂祥，等.卷烟烟气危害性指数研究.烟草科技，2009，2：5-15)的研究确定了对烟草主流烟气危害性影响最大的7项有害成分指标为氨(nh3)、一氧化碳(co)、总粒相物(hcn)、4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(nnk)、苯并芘(bap)、苯酚(phe)、巴豆醛(cro)。此外，鉴于烟草主流烟气中烟碱(cic)和焦油(tar)对人体健康的极大危害性，国内外烟草行业将上述9种有害成分统筹考虑，进而构建了一套科学评价烟草主流烟气中的危害性方法。

2、迄今，针对烟草主流烟气中9种代表性有害成分的研究主要集中在有害成分的检测方法及评价卷烟产品品质等方面，而针对烟草主流烟气中代表性有害成分的遗传分析研究，国内外仅有1例报道。即，童治军等(童治军，唐石云，徐永明，方敦煌，陈学军，冯颖杰，杨宗灿，刘文召，张婷婷，杨金初，肖炳光.卷烟主流烟气有害成分遗传分析.中国烟草科学，2023，44(3)：16-22)采用主基因+多基因sea-dh联合分析方法并结合烟草重组自交系群体(rils)对烟草主流烟气中9种代表性有害成分进行遗传分析，结果表明，9种烟草主流烟气有害成分(nh3、co、hcn、nnk、bap、phe、cro、cic和tar)性状的遗传变异主要由遗传因素决定，环境因素对其影响较小；上述具有极高遗传率的主基因/qtl存在将有助于进一步开展烟草低危害成分性状的分子标记辅助选择和基因/qtl定位研究。目前，除上述9种代表性烟草主流烟气中有害成分外，总粒相物(tpm)、危害性主流烟气(h)和烟气水分(moi)等也属于成品卷烟抽吸时释放的重要有害成分，但针对烟草主流烟气有害成分中的总粒相物释放量基因/qtl定位分析研究，国内外迄今尚未报道。故此，烟草主流烟气中总粒相物释放量基因/qtl定位分析的空白，严重地制约了低危害烟草品种的分子标记辅助选育，尤其是严重制约了利用与总粒相物释放量基因qtpm紧密连锁标记开展无总粒相物释放量的烟草低危害新品种的选育进程。

3、鉴于此，本发明首先以烤烟资源y3(主流烟气中具有高释放量的总粒相物，含基因qtpm)和主栽低危害烤烟品种k326(主流烟气中无总粒相物释放量，含基因qtpm)为亲本，通过杂交、连续套袋自交，构建一个含有269份株系的烟草重组自交系(rils_f8:9)为作图群体；其次，利用本实验室基于烤烟种质资源y3基因组信息开发的大规模ssr分子标记对269个rils_f8:9株系进行基因型分析，构建获得1张高质量烟草ssr分子遗传连锁图谱，该图谱含有2059个ssr标记且较均匀分布于烟草24条连锁群上，覆盖全基因组长度为1759.74cm；再次，待烟草成熟采烤后，切丝并手工卷制成单料烟支，按照gb/t 19609—2004规定，将卷制烟支置于sm450型直线型吸烟机上抽吸，采用气相色谱-质谱联用(gc-ms)方法、高效液相色谱(hplc)法和近红外光谱分析法(gb/t19609—2004)对主流烟气中的总粒相物(tpm)释放量进行检测；最后，利用数量性状连锁分析(qtl)法并结合rils_f8:9的基因型数据(遗传连锁图谱)和表型数据(总粒相物释放量)，在烟草全基因组范围内筛选获得与总粒相物释放量基因qtpm紧密连锁的共显性ssr标记，既有效填补了国内外关于烟草主流烟气中总粒相物释放量性状qtl定位分析的空白，又获得与总粒相物释放量基因qtpm紧密连锁的共显性ssr标记，是精准、高效利用分子标记辅助选择(mas)培育无总粒相物释放量的低危害烤烟新品种的重要途径。

技术实现思路

1、本发明正是为了解决烟草主流烟气中总粒相物释放量性状基因/qtl定位分析的空白，提供一种与烟草主流烟气中总粒相物释放量基因qtpm紧密连锁的共显性ssr标记及应用。

2、本发明的第一目的在于提供一种与烟草主流烟气中总粒相物释放量基因qtpm紧密连锁的共显性ssr标记；第二目的在于将上述共显性ssr标记应用于检测烟草基因组dna中是否存在总粒相物释放量基因qtpm及待测植株中总粒相物释放量性状的基因型状态。

3、本发明的创新点：本发明首次针对烟草主流烟气中的总粒相物释放量基因qtpm进行遗传定位分析。本发明人的研究表明，烟草主流烟气中总粒相物释放量属于典型的数量性状，且受烤烟种质y3基因组内第3条染色体的qtl控制，该基因/qtl被暂命名为qtpm。

4、本发明采用如下技术方案实现。

5、一种与烟草主流烟气中总粒相物释放量基因qtpm紧密连锁的共显性ssr标记，本发明所述的与烟草主流烟气中总粒相物释放量基因qtpm紧密连锁的共显性ssr标记的编号为tmy80731和tm36295，其pcr扩增产物核苷酸序列分别为seq id no.1和seq id no.2、seqid no.3和seq id no.4所示。

6、seq id no.1：

7、caggcccaccattctgtattttggattgggaatttttacatatacataaattttttggggtggacttaaatttgaatattggtacaattttatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatattgggatgaatcaattaaagccagatgttgccaaagtgacctttctaaaaagttttgtgcttgtaagttgtaacctatgtgaatatggtttggtccaaaggaaggtcaaagtttaacagaattacatgtgcaattttgtggtaataaatacgtgatagtttttggttttacgtgcgaa。

8、seq id no.2：

9、caggcccaccattctgtattttggattgggaatttttacatatacataaattttttggggtggacttaaatttgaatattggtacaattttatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatattgggatgaatcaattaaagccagatgttgccaaagtgacctttctaaaaagttttgtgcttgtaagttgtaacctatgtgaatatggtttggtccaaaggaaggtcaaagtttaacagaattacatgtgcaattttgtggtaataaatacgtgatagtttttggttttacgtgcgaa。

10、seq id no.3：

11、tgtgctgaaaacatcaacctgaatttcctattcttgactatatatatatatatatgatatatgcacaaaatgtcaacctggtgctaatctttctggtcagtcgtggcggcgttgaattttttatttgtaagttgactatatgatgaacatggtacgtagtctgagaagagcccaaaatttctaaacatgctttcagggttgctgcagtattg。

12、seq id no.4：

13、tgtgctgaaaacatcaacctgaatttcctattcttgactatatatatatatatatatatatatgatatatgcacaaaatgtcaacctggtgctaatctttctggtcagtcgtggcggcgttgaattttttatttgtaagttgactatatgatgaacatggtacgtagtctgagaagagcccaaaatttctaaacatgctttcagggttgctgcagtattg。

14、本发明所述共显性标记tmy80731和tm36295位于目的基因qtpm两侧。

15、本发明所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：

16、扩增tmy80731的引物序列为：

17、tmy80731f：5’-caggcccaccattctgtatt-3’(seq id no.5)，

18、tmy80731r：5’-ttcgcacgtaaaaccaaaaa-3’(seq id no.6)；

19、扩增tm36295的引物序列为：

20、tm36295f：5’-tgtgctgaaaacatcaacctg-3’(seq id no.7)，

21、tm36295r：5’-caatactgcagcaaccctga-3’(seq id no.8)。

22、上述的与烟草主流烟气中总粒相物释放量基因qtpm紧密连锁的共显性ssr标记的应用在于检测烟草基因组dna中是否存在总粒相物释放量基因qtpm及待测植株中总粒相物释放量性状的基因型状态。

23、本发明上述的应用，该应用的方法为，以tmy80731和tm36295序列的引物分别扩增待检测烟草基因组dna，检测pcr扩增产物。

24、本发明pcr扩增产物中同时含有如seq id no.1和seq id no.3所示序列则表明该待测烟草植株存在高总粒相物释放量的纯合等位基因，基因型为tpmtpm。

25、本发明pcr扩增产物中同时含有如seq id no.2和seq id no.4所示序列则为待测烟草植株无总粒相物释放量的纯合等位基因，基因型为tpmtpm。

26、本发明pcr扩增产物中同时含有如seq id no.1和seq id no.4所示序列，或同时含有如seq id no.2和seq id no.3所示序列则为待测烟草植株存在中等总粒相物释放量的杂合等位基因，基因型为tpmtpm。

27、为了快捷、高效选择无总粒相物释放量的低危害烟草品种，本发明有针对性地选择无总粒相物释放量基因qtpm的烟草后代材料，可用于无总粒相物释放量基因qtpm的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及无总粒相物释放量的低危害烟草品种选育效率。利用本发明提供的2个与烟草主流烟气中总粒相物释放量基因qtpm紧密连锁的共显性ssr标记，不仅可用于定性检测任何生育期的烟草基因组dna中是否存在总粒相物释放量基因qtpm，还可以清晰、精准鉴别待测植株中的总粒相物释放量性状的基因型状态(即，具有最高总粒相物释放量值且稳定遗传的纯合基因型tpmtpm、具有中等总粒相物释放量值且不能稳定遗传的杂合基因型tpmtpm、无总粒相物释放量且稳定遗传的纯合基因型tpmtpm)，进而既提高了无总粒相物释放量的低危害烤烟新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。

28、本发明与现有技术相比，其有益效果为：

29、1、填补了国内外关于烟草主流烟气中的总粒相物释放量基因qtpm遗传定位研究的空白。

30、2、清晰、精准检测烟草主流烟气中总粒相物释放量性状的基因型状态

31、提供了用于检测烟草主流烟气中总粒相物释放量基因qtpm的分子标记，既可精准确定待测烟草中是否存在总粒相物释放量，又可清晰的鉴别出待测烟草植株中总粒相物释放量性状的基因型状态。

32、3、检测方法高效、稳定、可靠，且操作简捷和低成本

33、与现有的采用低通量、高成本、耗时费力的gc-ms法、hplc法和近红外光谱分析法检测烟草主流烟气中的总粒相物有害成分(tpm)释放量相比，本发明所述的共显性ssr标记具有高效、稳定、可靠、简捷和低成本的特点。

34、4、不限检测时机

35、本方法可在烟草生长的任何时期进行检测，尤其是在烟草幼苗期的检测，彻底且完美避开了漫长的烟草生长周期及采收、烘烤、叶片切丝、烟支卷制、吸烟机抽吸和耗时费力的检测等过程，极显著的缩短了检测周期，进而加速了无总粒相物释放量的低危害烤烟新品种选育进程。

36、下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。