一种RNA定量检测试剂盒、方法及其应用

本发明涉及生物化学，特别是涉及一种rna定量检测试剂盒、方法及其应用。

背景技术：

1、胃癌作为全球第五大癌症，长期以来危害着人类的健康。癌症相关rna检测作为确诊的重要指标，在临床实践中受到广泛重视。如何准确快速地检出rna，确保结果的准确可靠，是每个检测实验室必须面对的考验。目前rna检测最常用方法是实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)和rna测序。基于核酸检测的实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)具有灵敏度高、结果准确的优势，已成为病原感染确诊的金标准，但是需要专业的实验室条件及仪器设备，以及耗时长的核酸提取及扩增过程。rna测序是一种高通量的方法，可以对rna样品进行全面和定量的分析，提供深入了解rna分子的全貌，但是测序需要较高的成本和复杂的数据分析。此外对于低表达的rna，技术特异性和灵敏度可能有限。因此亟需开发一种高灵敏、超快速的rna检测技术。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种rna定量检测试剂盒、方法及其应用，本发明提供的试剂盒灵敏度高，方便快捷、成本低，且适用于多种生物样品中rna的定量检测。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种rna定量检测试剂盒，包括吸水剂和至少一种荧光探针；所述吸水剂选自有机化合物，所述有机化合物化学式为cxhyoz，4≤x≤6，8≤y≤12，1≤z≤2，且含羟基、羰基、醛基、羧基、酯基中的任一官能团；所述荧光探针均包括能与目标rna特异性结合的核苷酸片段，以及荧光基团和淬灭基团。

3、进一步，所述吸水剂选自异丁醇、正丁醇、正戊醇、异戊醇、环己酮、乙酸乙酯中的至少一种；

4、进一步，所述目标rna选自mir-1246、mir-183、mir-21、mir-142中的至少一种。

5、进一步，与mir-1246特异性结合的核苷酸片段序列为：ctttttttgctttgagcatg(seq id no.1)。

6、进一步，与mir-183特异性结合的核苷酸片段序列为：tcagccgctgcacacgcac(seqid no.2)。

7、进一步，与mir-21特异性结合的核苷酸片段序列为：acgcacagcctagacatc(seq idno.3)。

8、进一步，与mir-142特异性结合的核苷酸片段序列为：tgagcatgccagtacatc(seqid no.4)。

9、进一步，所述荧光探针选自以下荧光探针中的至少一种：特异性检测mir-1246的荧光探针，特异性检测mir-183的荧光探针，特异性检测mir-21的荧光探针，特异性检测mir-142的荧光探针；

10、所述特异性检测mir-1246的荧光探针的核苷酸序列为：

11、5’-agctagctagctagctttttctttttttgctttgagcatggatgtactaggcatgccaaaagcaa-3’(seq id no.5)；

12、所述特异性检测mir-183的荧光探针的核苷酸序列为：

13、5’-agctagctagctagcttttttcagccgctgcacacgcacaggatgtactaggc tgtgcgtggacagc-3’(seq id no.6)；

14、所述特异性检测mir-21的荧光探针的核苷酸序列为：

15、5’-ctgactgactgactgattttacgcacagcctagacatcctgtgcgtggacagc gatgtactagg-3’(seq id no.7)；

16、所述特异性检测mir-142的荧光探针的核苷酸序列为：

17、5’-ctgactgactgactgatttttgagcatgccagtacatccatgctcaaaagcaa gagtactagg-3’(seq id no.8)。

18、进一步，所述荧光基团选自羧基荧光素fam、羧基-x-罗丹明rox、花青染料分子cy3、cy5花青染料分子中的任意一种，所述指淬灭基团选自bhq1、bhq2中的任意一种。

19、进一步，所述特异性检测mir-1246的荧光探针为：

20、5’-agctagctagctagctttttctttttttgcttt/ibhq2dt/gagcatggatgtactaggcatgc/icy3dt/caaaagcaa-3’；

21、进一步，所述特异性检测mir-183的荧光探针为：

22、5’-agctagctagctagcttttttcagccgctg/i6famdt/cacacgcacaggatgtactaggctgtgcgtg/ibhq1dt/gacagc-3’；

23、进一步，所述特异性检测mir-21的荧光探针为：

24、5’-ctgactgactgactgattttacgcacagcctag/ibhq2dt/acatcctgtgcgtg/icy5dt/gacagcgatgtactagg-3’；

25、进一步，所述特异性检测mir-142的荧光探针为：

26、5’-ctgactgactgactgatttttgagcatgcc/ibhq2dt/agtacatccatgctcaa aagcaaga/iroxdt/gtactagg-3’。

27、进一步，所述rna检测试剂盒还包括至少一种目标rna标准品，优选为浓度已知的目标rna标准品。

28、进一步，所述目标rna标准品选自mir-1246标准品、mir-183标准品、mir-21标准品、mir-142标准品中的至少一种。

29、进一步，所述rna检测试剂盒还包括缓冲液，所述缓冲液优选为pbs缓冲液。

30、本发明还提供一种rna定量检测方法，采用如上所述的rna定量检测试剂盒，对待检测样本中的目标rna进行定量检测。

31、进一步，所述rna定量检测方法包括：

32、将至少一种目标rna标准品、至少一种荧光探针和吸水剂配制成第一反应体系，将第一反应体系进行聚合酶链式反应(pcr)，然后测量荧光强度，分析所得荧光强度与每种目标rna标准品浓度之间的对应关系；

33、将待检测样本、至少一种目标rna标准品、至少一种荧光探针和吸水剂配制成第二反应体系，将第二反应体系进行聚合酶链式反应(pcr)，然后测量荧光强度，根据所得荧光强度以及所述对应关系获得所述待检测样本中每种目标rna的含量。

34、进一步，所述聚合酶链式反应(pcr)程序包括：95℃预变性5min；25℃静置30min。

35、进一步，所述第一反应体系和/或第二反应体系中，吸水剂的体积分数为40％～60％。

36、进一步，采用线性方程表征荧光强度与每种目标rna标准品浓度之间的对应关系。

37、进一步，表征荧光强度与mir-1246标准品、mir-183标准品、mir-21标准品、mir-142标准品浓度之间的对应关系的线性方程分别如式(ⅰ)至(ⅳ)所示：

38、i＝1495×logc+ 13404       (ⅰ)，

39、i＝ 572.5×logc+ 5220       (ⅱ)，

40、i＝544×logc + 5603         (ⅲ)，

41、i＝ 734.8×logc + 7929       (ⅳ)，

42、式中，i是指荧光强度，c是指目标rna标准品浓度。

43、进一步，所述rna定量检测方法还包括：根据测量所得荧光强度与预设荧光强度阈值之间的关系区分突变序列和正常序列；其中，所述突变序列选自单碱基突变序列、多碱基突变序列和随机突变序列中的至少一种。

44、本发明还提供如上所述的rna定量检测试剂盒和/或rna定量检测方法在制备癌症诊断试剂中的应用。

45、如上所述，本发明的rna定量检测试剂盒、方法及其应用，具有以下有益效果：

46、本发明针对于不同目标rna(如癌症相关mirna)设计了不同的荧光探针，当探针上特异序列与目标rna结合时，探针的构型会由稳定态被打开，导致修饰在探针上的荧光基团和淬灭基团距离变远从而释放荧光；而且，本发明设计的荧光探针具有很好的特异性和重复性；同时，加入吸水剂后，由于吸水剂的吸水作用，产生动态相分离，促使探针和mirna聚集到一起，从而大大缩短反应速度。因此，本发明提供的rna定量检测技术具备反应快速、灵敏度高、特异度好、准确性高、操作简便、适用范围广泛等特点，有利于实现快速的癌症相关mirna的早期诊断。