一种特异性识别微囊藻毒素的适配体及其应用

本发明属于生物医学，涉及一种与微囊藻毒素特异性结合的核酸适配体及其应用。

背景技术：

1、在淡水的蓝藻水华中研究最多最普遍的蓝藻毒素是微囊藻毒素(microcystins，mcs)。该毒素是一类具有生物活性的环状七肽化合物，主要由蓝藻水华中铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)等淡水蓝藻产生，研究表明现有300多种微囊藻毒素的变体，常见有mc-lr、mc-rr、mc-ly(l、r、y分别代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸)等类型，对饮用水安全和人体健康安全造成了严重威胁。mcs污染已成为各国共同面对的一个环境科学问题，who和我国gb 5749-2006生活饮用水卫生标准规定饮用水中mcs的控制标准为1μg·l-1。

2、目前mcs的检测方法主要有以下三种：(1)生物学检测方法：包括动物毒性试验、细胞毒性试验，该方法操作简单、快速直观，但所需量较大，灵敏性、专一性不高；(2)生物化学分析法：主要包括酶联免疫测定(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)，主要是基于抗原和抗体间特异性识别作用来对mcs实施检测，但由于试剂盒的标准不统一，使得检测结果可靠性降低；(3)物理化学检测法：高效液相色谱(high-erformance liquidchromatography，hplc)、质谱(mass spectrometry，ms)、液相色谱-质谱联用法(liquidchromatography-mass spectrometry，lc-ms)、毛细管电泳(capillary electrophoresis，ce)、薄层层析(thin layer chromatography，tlc)和核磁共振法(nuclear magneticresonance spectroscopy，nmr)等。这些方法灵敏度较高，但都存在设备昂贵、操作技术含量高，以及样品基质物质对检测结果影响较大、无法满足现场检测的要求等局限性。

3、近年来，生物传感器检测法因能克服传统检测方法的众多缺点而备受研究者们的关注。生物传感器的核心部件是分子识别元件，抗体是一种发展完善且备受关注的分子识别元件，但是，抗体不仅价格昂贵，容易变性，还会出现批次间的差异。因此，需要寻找一种新的分子识别元件。

4、核酸适配体是一种新型的分子识别元件，被称为“化学抗体”。它是一种能与靶标特异性结合的单链寡核苷酸，通过指数富集的配体系统进化((systematic evolution ofligands by exponential enrichment，selex)技术筛选获得，有特异性好、稳定性高、易于合成、便于修饰和免疫原性低等优点。作为一种新型分子识别元件，适配体与抗体相似，但优于抗体。例如，适配体能够识别多种靶标，如蛋白质、氨基酸以及金属离子等，甚至细胞和病毒；适配体能够与多种基团连接，修饰方便；适配体化学性质稳定,不容易变性；适配体可以直接化学合成，成本低廉。

5、针对现有检测技术的不足，以及mcs污染越来越严峻的态势，研究更便捷、高效的新型mcs检测方法，对水源和水产品质量进行有效地跟踪监测，成为一项迫在眉睫的任务。

技术实现思路

1、本发明提供了一种核酸适配体，其核苷酸序列如seq id no:1所示，该核酸适配体二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能dg＝-9.8，其能与微囊藻毒素(mcs)特异性结合；本发明提供了一种用于mcs检测、成本低、稳定性好的适配体，使采用生物传感器检测法检测mcs成为可能，大幅提高mcs检测的灵敏性、准确性，降低检测成本。

2、本发明另一目的是将上述核酸适配体应用在制备识别微囊藻毒素的试剂或检测微囊藻毒素试剂盒中。

3、本发明目的通过以下技术方案实现：

4、1、采用文库固定的capture-selex方法筛选与微囊藻毒素特异性结合的核酸适配体；

5、2、使用mfold软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/dna-folding-form)对与微囊藻毒素特异性结合的核酸适配体mcs-12单链dna分子进行二级结构预测；结果表明，其二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能dg＝-9.8；

6、3、核酸适配体的特异性、亲和力及其对微囊藻毒素的灵敏性检测，结果显示mcs-12的解离常数kd＝19.47±5.346nmol/l，其与mcs能特异性的结合，能检测到微囊藻毒素的最低浓度为0.22μg/l；

7、4、采用核酸适配体mcs-12对实际水样中微囊藻毒素的检测。

8、本发明的优点和技术效果：

9、1、本发明弥补了尚无与mcs特异性结合的适配体的空白，提供的核酸适配体能与微囊藻毒素(mc-lr、mc-rr、mc-ly)特异性结合，检测灵敏度高、亲和力强、稳定性好，可以用于mcs的检测，进而有效防止接触、误食mcs污染的水和水产品引起的中毒；

10、2、本发明提供的核酸适配体制备成本低、免疫原性低、性质稳定、方便修饰，可以大幅降低mcs的检测成本、简化检测过程、提高检测准确性和效率。

技术特征：

1.一种特异性识别微囊藻毒素的核酸适配体，其核苷酸序列如seq id no:1所示。

2.权利要求1所述的核酸适配体在制备识别微囊藻毒素的试剂或在制备检测微囊藻毒素试剂盒中的应用。

技术总结本发明公开了一种特异性识别微囊藻毒素的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，本发明以微囊藻毒素为靶标，利用Capture‑SELEX技术通过多轮筛选过程富集适配体，应用荧光检测监测筛选进程，高通量测序得到适配体序列信息，通过对比吉布斯自由能，得到吉布斯自由能较低的核酸适配体MCs‑12；所述核酸适配体MCs‑12是ssDNA，由87个核苷酸组成，其二级结构含有突出的环和茎，核酸适配体MCs‑12吉布斯自由能DG＝‑9.8，基于胶体金分光光度法对筛选获得的核酸适配体特异性、亲和力评估，实验结果显示核酸适配体MCs‑12能特异性与MCs结合，其可以用于MCs的检测，进而有效防止接触、误食MCs污染的水和水产品引起的中毒，该核酸适配体在准确、快速、灵敏检测水样中微囊藻毒素方面具有广泛的应用前景。技术研发人员：韩芹芹,彭中美,宋玉竹,张金阳受保护的技术使用者：昆明理工大学技术研发日：技术公布日：2024/9/9