一种核酸适配体及其在识别微囊藻毒素中的应用

本发明属于生物医学，涉及一种与微囊藻毒素特异性结合的核酸适配体及其应用。

背景技术：

1、近年来，随着工业与经济的飞速发展，农业、工业和城市污水处理不当引发的水体富营养化成为了环境污染的重要问题。水体富营养化会导致水质恶化、浮游植物藻类大量繁殖形成水华。微囊藻毒素(microcystins，mcs)是由蓝藻水华中微囊藻属、浮丝藻属、鱼腥藻属等产生的毒素，是最常见的蓝藻毒素，具有肝毒性、肾毒性、神经毒性、生殖毒性等多种毒性。当mcs进入人体，会被血液吸收，接着被运送到各种器官后，随着浓度的积累会导致慢性中毒，出现恶心、头晕、呕吐等症状，对水生态安全和人类健康构成严重威胁。mcs的分子量在800～1100da之间，是一种环状七肽肝毒，根据可变氨基酸的不同，有数十种异构体。其中x和y是可变的l-氨基酸，d-me-asp代表d-β-甲基天冬氨酸，adda是(2s，3s，8s，9s)-3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基癸-4，6-二烯酸，也是表达mcs毒性的必须基团。mdha是n-甲基脱氢丙氨酸。最普遍、含量最高、毒性较大的3种异构体分别为微囊藻毒素-lr(microcystin-lr，mc-lr)、微囊藻毒素-rr(microcystin-rr，mc-rr)和微囊藻毒素-yr(microcystin-yr，mc-yr)(l、r和y分别表示化学结构中的亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)。由于mcs的环状结构具有强稳定性、难挥发、耐酸碱与高温，不能被常见的一些蛋白质或多肽水解酶降解，在去离子水中可保持稳定状态长达27d。mcs也是水生动物(淡水鱼、虾等)和微藻源新型食品中的一种重要危害因子。mcs在微藻源食品中具有重大的残留风险。因此mcs的检测对保障水产品食用安全与人们健康具有重要意义。

2、近年来，生物传感器检测法因能克服传统检测方法的众多缺点而备受研究者们的关注。生物传感器的核心部件是分子识别元件，抗体是一种发展完善且备受关注的分子识别元件，但是，抗体不仅价格昂贵，容易变性，还会出现批次间的差异。因此，需要寻找一种新的分子识别元件。

3、核酸适配体是单链dna或rna自身经过卷曲折叠形成的三级结构，其经典的筛选方法是指数富集的配基系统进化(systematic evolution ofligands by exponentialenrichment，selex)技术。核酸适配体可通过分子间相互作用力，如氢键、范德华力等与细胞、蛋白、核酸、脂质、生物小分子等多种靶标物质发生高亲和力、强特异性的结合。因其具备抗体的优良特性，且具有稳定性高、易于合成和修饰、方便储存及运输、免疫原性低、制备过程不需要使用免疫动物等优点，因此被称为“化学抗体”，作为新型的分子识别元件，在诊断、检测、治疗、科学研究等领域备受关注。

4、针对现有检测技术的不足，以及mcs污染越来越严峻的态势，研究更便捷、高效的新型mcs检测方法，对水源和水产品质量进行有效地跟踪监测，成为一项迫在眉睫的任务。

技术实现思路

1、本发明提供了一种核酸适配体，其核苷酸序列如seq id no:1所示，该核酸适配体二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能dg＝-12.86，其能与微囊藻毒素(mcs)特异性结合；本发明提高mcs检测的灵敏性、准确性，降低检测成本，使采用生物传感器检测法检测mcs成为可能。

2、本发明另一目的是将上述核酸适配体应用在制备检测微囊藻毒素的试剂或检测微囊藻毒素试剂盒中。

3、本发明目的通过以下技术方案实现：

4、1、采用文库固定的capture-selex方法筛选与微囊藻毒素特异性结合的核酸适配体；

5、2、使用mfold软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/dna-folding-form)对与微囊藻毒素特异性结合的核酸适配体mcs-4单链dna分子进行二级结构预测，结果表明其二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能dg＝-12.86；

6、3、核酸适配体mcs-4的特异性、亲和力检测结果显示，mcs-4的解离常数kd＝15.98±1.952nmol/l，其与mcs能特异性的结合，能检测到微囊藻毒素的最低浓度为0.19μg/l；

7、4、采用核酸适配体mcs-4对实际水样中微囊藻毒素的检测。

8、本发明的优点和技术效果：

9、1、本发明提供的核酸适配体能与微囊藻毒素(mc-lr、mc-rr、mc-ly)特异性结合，且检测灵敏度高、亲和力强、稳定性好，可以用于水源、水产品中mcs的检测，进而有效防止接触、误食mcs污染的水和水产品引起的中毒；

10、2、本发明提供的核酸适配体制备成本低、免疫原性低、性质稳定、方便修饰，可以大幅降低mcs的检测成本、简化检测过程、提高检测准确性和效率，本发明可用于工业化生产和市场推广应用。

技术特征：

1.一种核酸适配体，其核苷酸序列如seq id no:1所示。

2.权利要求1所述的核酸适配体在制备检测微囊藻毒素的试剂或检测微囊藻毒素试剂盒中的应用。

技术总结本发明公开了一种核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的核酸适配体是单链DNA，由87个核苷酸组成，其二级结构含有突出的环和茎，其中MCs‑4吉布斯自由能DG＝‑12.86，基于胶体金分光光度法对核酸适配体MCs‑4的特异性、亲和力进行评估，结果显示MCs‑4解离常数Kd＝15.98±1.952nmol/L，且能特异性与微囊藻毒素结合，因此该核酸适配体具有高特异性、高亲和力的特点，可快速、灵敏地用于水和水产品中微囊藻毒素的检测。技术研发人员：韩芹芹,彭中美,宋玉竹,张金阳受保护的技术使用者：昆明理工大学技术研发日：技术公布日：2024/9/9