猴痘病毒恒温荧光检测引物和探针、试剂盒

本发明属于分子生物，涉及微生物检测，具体是涉及一种猴痘病毒恒温荧光检测引物和探针、试剂盒。

背景技术：

1、猴痘病毒(simian poxvirus，spv/monkeypox virus，mpv)是一种双链dna病毒，与天花病毒(variola virus，varv/smallpox virus)同属于痘病毒科，正痘病毒属。猴痘感染的症状与天花相似，俗称“猴天花”，可通过直接接触患者或者被感染的动物，或通过患者的体液传播。猴痘病毒可分为西非和刚果盆地两个分支，其中西非分支的致死率约1％，刚果盆地分支的致死率约为10％。

2、近年来，人类感染猴痘病毒的病例明显增加，猴痘病毒存在进一步传播的可能性，这使人们提高了对这种新出现的疾病的关注程度。世界卫生组织(who)于2022年7月23日宣布当前的猴痘疫情为国际关注的突发公共卫生事件(pheic)。目前已有82个非流行国家报告了近3.2万例猴痘确诊病例。

3、猴痘病毒基因组全长197kb，中央基因组区域长101kb。两个终端变量区域都包括一个6379bp的末端倒置重复(itr)，具有大约80bp长的发夹环或54bp的短串联重复序列以及独特的itr序列nr 1和nr 2以及编码区。该病毒包含大约190个不重叠的开放阅读框(orf)，其中四个位于itr序列中。负责病毒复制、转录、组装和释放的基因保守地位于基因组的中心区域，而大多数表达毒力和宿主嗜性的基因都存在于基因组的两端。这些末端基因通过干扰抗原的信号传导、呈递和识别以及细胞凋亡，在免疫逃避中发挥作用。

4、猴痘病毒基因组的中心区域(编码必需酶和结构蛋白)与天花病毒之间存在96.3％的同一性，这意味着它们在遗传上高度相似。因此临床上常用的抗原抗体杂交的检测方法对于猴痘病毒感染诊断无效，因为抗原抗体检测方法无法区分不同种类的正痘病毒。目前通过聚合酶链反应检测病毒dna是针对猴痘感染的首选实验室检测方法。最佳诊断的标本是皮肤或黏膜上皮疹的液体或结痂。

5、猴痘病毒感染的潜伏期为5-21天，在病程早期仅出现非特异性症状，例如发热、流感样症状和淋巴结症状，发烧后1-5天内出现面部和身体皮疹。它很容易被误诊为其他疾病，如水痘和covid-19，这使得mpv隐性传播的风险很高。因此对高风险人群及疑似病例进行快速检测、鉴别分类对遏制猴痘的快速传播至关重要。

6、目前，国内外针对猴痘病毒的检测还是主要集中在传统的检测方式，如qpcr检测技术，这种方法操作复杂、成本高昂、需要热循环，需配备大型仪器，因此不适用于现场及时检测。新兴的检测方法，如环介导等温扩增技术(lamp)也被用于猴痘的检测，环介导等温扩增技术虽然较传统方式可以缩短时间，但反应时间也需要40-60min，且需4-6对引物，设计较复杂，无法实现真正的快检。使用简单、便携和低成本仪器的高效体外核酸扩增技术在疾病诊断、突变检测和生物防御中至关重要。

7、多酶恒温快速扩增(mira)技术是新一代体外扩增技术，原理是模拟生物体内核酸修复与自我复制的生物酶体系，借助多种生物酶在体温恒温(37℃-42℃)条件下实现核酸超快速扩增的技术。该技术打破pcr(聚合酶链式反应)技术以精确的温度变化来实现dna变性、退火、延伸的局限性，摆脱昂贵的精确控温设备的依赖，在扩增效率、便捷性，灵敏度上都有极高的提升。与传统检测技术相比，生物酶高效、精确的特点使多酶恒温快速扩增技术能够快速、准确地进行核酸检测，将原本需要2-3小时的核酸体外扩增缩短至20分钟内完成。

8、鉴于此，建立简单、快速、高灵敏度的猴痘病毒快速检测方法，开发适用于目前临床使用和科研用的猴痘快速检测产品是非常有必要的。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的是提供了一种猴痘病毒恒温检测荧光型试剂盒，包括引物、探针、恒温核酸扩增体系及干粉试剂，其可以对猴痘病毒感染进行快速、实时、特异性检测。

2、为实现上述目的，包括以下技术方案。

3、本发明的第一个方面，是提供了一种猴痘病毒检测的引物探针组合，包括：上游引物、下游引物和探针，其序列组成分别如seq id no:1、seq id no:6和seq id no:12所示。

4、本发明的第二个方面，是提供了述的引物探针组合在制备猴痘病毒检测试剂盒中的应用。

5、本发明的第三个方面，是提供了一种猴痘病毒检测的恒温荧光试剂盒，所述试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，其其序列组成分别如seq id no:1、seq id no:6和seqid no:12所示；其中，所述探针的5’端修饰有荧光标记，在距5’端28nt序列位置上四氢呋喃标记的核酸内切酶nfo的识别位点，3’末端标记修饰基团c3-spacer；下游引物的5’端标记有生物素。

6、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括冻干粉，所述冻干粉中包括维持酶促反应混合物以及工程酶混合物，所述工程酶混合物包括重组酶520-725ng/μl；单链dna结合蛋白100-200ng/μl；dna聚合酶350-450ng/μl；核酸内切酶300-400ng/μl的溶液冻干而成。

7、在其中的一些实施例中，维持酶促反应混合物的组分包括：聚乙二醇，4-5wt％；tris，20-30mm；乙酸钠，200-240mm；二硫苏糖醇，8-10mm；酸磷酸腺苷，8-10mm；磷酸肌酸二钠盐，80-100mm；磷酸肌酶，80-120ng/μl；脱氧核糖dntp，450-500μm；海藻糖，10-12wt％；甘露醇，40-50ng/μl。

8、在其中的一些实施例中，所述冻干粉的制备方法包括以下步骤：将冻干粉的全部组分在-80℃条件下预冻1～1.5小时得到预冻试剂，将预冻试剂先置于-35～-45℃环境下干燥2～10小时，再置于10～18℃环境下干燥1～2小时，得到冻干粉。

9、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括abuffer、bbuffer和ddh2o；所述abuffer包括：25-30mm tris-hci，125-175mm kci，3-8v/v％peg,0.8-1.2v/v％triton-x100，所述abuffer的ph为8.0～9.0，所述b buffer包括：190-200mm醋酸镁。

10、本发明的第四个方面，是提供了一种猴痘病毒检测的反应体系，所述反应液体系中有上述反应液，反应液中再加入上游引物、下游引物、探针，所述上游引物的序列如seqid no:1所示，所述下游引物的序列如seq id no:6所示，所述探针的序列如seq id no:12所示，所述引物和探针的在反应体系中的浓度分别为10μm。

11、本发明的第四个方面，是提供了一种非疾病诊断目的的猴痘病毒核酸的检测方法，包括以下步骤：

12、s1、提取待测样本中的核酸；

13、s2、将提取到的核酸加到上述的猴痘病毒检测的反应体系中；

14、s3、将加入核酸后的反应体系加入上述冻干粉中充分溶解混匀后，直接或置于温控设备中孵育4分钟，通过荧光定量pcr仪进行荧光扩增检测，进行荧光扩增检测。

15、其中一些实施例中，所述待测样本选自咽拭子、皮疹渗出物拭子、痘疱液、痘疱表皮、痘痂、全血、血清等体液中的至少一种。

16、本发明开发了基于多酶恒温快速扩增(mira)技术的猴痘病毒恒温检测荧光

17、型试剂盒，设计得到最优检测效果的一组特异性检测猴痘病毒的引物探针，其与恒温核酸扩增体系结合，实现20分钟内对猴痘病毒的高特异性和高灵敏度检测。本发明所述的猴痘病毒恒温检测荧光型试剂盒还通过液氮急冻和超低温冷冻干燥技术将检测体系的重要组成部分冻干成干粉试剂。干粉试剂复溶性好、扩增性能稳定，储存及运输简便。