一种抗猴痘病毒单克隆抗体及其应用

本发明涉及抗体工程领域，尤其涉及猴痘病毒人源单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、猴痘病毒(monkeypox virus，mpxv)属于痘病毒科(poxviridae)，脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxvirinae)，正痘病毒属(orthopoxvirus，opxv)。正痘病毒属有10多个成员，其中包括天花病毒(varv)、牛痘(天花疫苗)病毒(vacv)、牛瘟病毒(cpxv)、骆驼痘病毒(cmlv)，以及自2010年以来从感染的人类或灵长类动物中分离的几个新物种。根据vacv和mpxv之间的比较，痘病毒之间的表面蛋白表现出大约93-98％的序列相似性，暗示它们在进入机体过程中扮演类似的角色。

2、

3、猴痘是一种人畜共患病，其自然宿主还未明确，主要是在啮齿类动物以及非人灵长类中传播。可通过接触皮肤受损组织等多种形式进行传播。此外，近期猴痘病毒在非流行国家中的传播呈现出与性接触有关的现象，已经在精液等体液中发现了猴痘病毒的存在，但是否通过性接触传播还未明确。感染后会出现淋巴结肿大、肌肉酸痛以及脓包破裂后留下永久性瘢痕等症状。

4、自1980年消灭天花以及随后人类停止接种天花疫苗，导致现在年轻群体对正痘病毒的免疫能力较低，可能是导致当前mpox爆发的原因之一。随着多种猴痘病毒毒株在非流行国家中传播，不仅传播途径多样、隐蔽，感染症状非典型，而且猴痘病毒在人际传播中还加速变异，其突变速率远远超出预期，对全球公共卫生安全构成越来越大的威胁。虽然现在国内的猴痘病例并不多，但是随着境内外人口流动，如何防治猴痘感染就成了亟待解决的关键问题。且目前尚无特定的抗病毒疗法被批准用于治疗人类mpxv感染。我们迫切地需要更多研究这种病毒来更好地预防与治疗猴痘。

5、迄今为止，中和抗体已被证明是治疗病毒性疾病的有效方法，包括人免疫缺陷病毒(hiv)、流感病毒和其它黄病毒等。mpxv存在胞外囊膜病毒(extracellular envelopedvirus，eev)和胞内成熟病毒(intracellular mature virus，imv)粒子两种形式。其中，a29l和e8l蛋白是imv表面的囊膜蛋白，在病毒感染过程中起关键作用。

6、已经有人成功制备了3种识别mpxv a29l不同表位的单抗，9f8、3a1和2d1，它们均证实对正痘病毒具有较强的广泛结合和中和活性，其中9f8的中和活性最好，同时对正痘病毒具有协同保护作用。也有人曾经表征了几种人源抗d8抗体的结合特性，并解析了三种分别与d8结合的vacv-mab变体vacv-66、vacv-138和vacv304的晶体结构。

7、研发特异的、与抗原结合能力强、体外中和性好、亲和力大、具有体内保护作用的新的猴痘病毒中和抗体是非常重要和必要的。

技术实现思路

1、发明所要解决的问题：

2、针对现有技术存在的问题，本发明通过筛选全人抗体人源化小鼠抗a29l特异结合的记忆b细胞，获得的人源高中和活性的mpxv抗体a29l-1b3、a29l-1b2、a29l-1a5和a29l-1a2，最终筛选出特异的、与猴痘病毒结合能力强、体外中和性好、亲和力大新的猴痘病毒人源化单克隆抗体。

3、为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

4、一、猴痘病毒a29l单克隆抗体的制备和纯化

5、通过猴痘病毒a29l蛋白的表达与纯化、与a29l蛋白结合的特异性记忆b细胞的分选、对猴痘病毒a29l抗体的表达及纯化，获得4种猴痘病毒a29l单克隆抗体，分别为a29l-1b3、a29l-1b2、a29l-1a5和a29l-1a2，这4种猴痘病毒单克隆抗体轻链与重链的氨基酸序列、轻链可变区cdr1-3、重链可变区cdr1-3如下，轻链可变区和重链可变区跟已有序列都有不同，具有特异性。

6、二、单克隆抗体的性能验证

7、(一)elisa检测a29l抗原和抗体结合活性

8、a29l-1b3、a29l-1b2、a29l-1a5和a29l-1a2四种抗体均可以结合抗原，随着抗体浓度增加结合活性增强，od450值增大。

9、(二)抗原和抗体中和试验

10、通过空斑法检测抗体的中和活性a29l抗体对vacv-wr的中和曲线结果，a29l-1a2、a29l-1a5、a29l-1b2、a29l-1b3的ic50分别为0.026、0.085、0.029、0.0411。

11、(三)表面等离子共振技术检测抗体与抗原亲和力

12、a29l-1b3、a29l-1b2、a29l-1a5和a29l-1a2四种抗体与抗原亲和力较好。

13、(四)动物保护试验

14、低剂量病毒感染情况下，多次给予a29-1a2抗体可对猴痘病毒感染小鼠提供保护。

15、与现有技术相比，本申请的有益效果在于：

16、本发明的人源化单克隆抗体抗体与猴痘病毒结合能力强、体外中和性好、亲和力大、具有体内保护作用，与已经报道的猴痘病毒抗体序列完全不同，为猴痘病毒的检测、中和提供了产品，为提供具有体内保护作用的猴痘病毒产品提供了可能。

技术特征：

1.一种中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3，其特征在于，所述中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3轻链cdr1的氨基酸序列为seq id no:1所示，轻链cdr2的氨基酸序列为seq id no:2所示，轻链cdr3的氨基酸序列为seq id no:3所示；

2.如权利要求1所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3，其特征在于，所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3的轻链氨基酸序列如seq id no:7所示，所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3的重链氨基酸序列如seq id no:8所示。

3.如权利要求1所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3，其特征在于，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3的轻链cdr1的核苷酸序列如seq id no:9所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3的轻链cdr2的核苷酸序列如seqid no:10所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3的轻链cdr3的核苷酸序列如seq id no:11所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3的重链cdr1的核苷酸序列如seq id no:12所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3的重链cdr2的核苷酸序列如seq id no:13所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3的重链cdr3的核苷酸序列如seq id no:14所示。

4.如权利要求1所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3，其特征在于，编辑所述中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3轻链的核苷酸序列如seq id no:15所示，编辑所述中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3重链的核苷酸序列如seq id no:16所示。

5.如权利要求1-4任意一项所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b3在制备检测猴痘病毒的产品中的应用。

6.一种中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2，其特征在于，所述中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2轻链cdr1的氨基酸序列为seq id no:17所示，轻链cdr2的氨基酸序列为seq id no:18所示，轻链cdr3的氨基酸序列为seq id no:19所示；

7.如权利要求6所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2，其特征在于，所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2的轻链氨基酸序列如seq id no:23所示，所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2的重链氨基酸序列如seq id no:24所示。

8.如权利要求6所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2，其特征在于，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2的轻链cdr1的核苷酸序列如seq id no:25所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2的轻链cdr2的核苷酸序列如seq id no:26所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2的轻链cdr3的核苷酸序列如seq id no:27所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2的重链cdr2的核苷酸序列如seq id no:28所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2的重链cdr2的核苷酸序列如seq id no:29所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2的重链cdr3的核苷酸序列如seq id no:30所示。

9.如权利要求6所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2，其特征在于，编辑所述中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2轻链的核苷酸序列如seq id no:31所示，编辑所述中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2重链的核苷酸序列如seq id no:32所示。

10.如权利要求6-9任意一项所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1b2在制备检测猴痘病毒的产品中的应用。

11.一种中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5，其特征在于，所述中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5轻链cdr1的氨基酸序列为seq id no:33所示，轻链cdr2的氨基酸序列为seq id no:34所示，轻链cdr3的氨基酸序列为seq id no:35所示；

12.如权利要求11所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5，其特征在于，所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5的轻链氨基酸序列如seq id no:39所示，所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5的重链氨基酸序列如seq id no:40所示。

13.如权利要求11所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5，其特征在于，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5的轻链cdr1的核苷酸序列如seq id no:41所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5的轻链cdr2的核苷酸序列如seq id no:42所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5的轻链cdr3的核苷酸序列如seq id no:43所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5的重链cdr1的核苷酸序列如seq id no:44所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5的重链cdr2的核苷酸序列如seq id no:45所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5的重链cdr3的核苷酸序列如seq id no:46所示。

14.如权利要求11所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5，其特征在于，编辑所述中和猴痘病毒的人源单克隆抗体e8l-7e7轻链的核苷酸序列如seq id no:47所示，编辑所述中和猴痘病毒的人源单克隆抗体e8l-7e7重链的核苷酸序列如seq id no:48所示。

15.如权利要求11-14任意一项所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a5在制备检测猴痘病毒的产品中的应用。

16.一种中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2，其特征在于，所述中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2轻链cdr1的氨基酸序列为seq id no:49所示，轻链cdr2的氨基酸序列为seq id no:50所示，轻链cdr3的氨基酸序列为seq id no:51所示；

17.如权利要求16所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2，其特征在于，所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2的轻链氨基酸序列如seq id no:55所示，所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2的重链氨基酸序列如seq id no:56所示。

18.如权利要求16所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2，其特征在于，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2的轻链cdr1的核苷酸序列如seq id no:57所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2的轻链cdr2的核苷酸序列如seq id no:58所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2的轻链cdr3的核苷酸序列如seq id no:59所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2的重链cdr1的核苷酸序列如seq id no:60所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2的重链cdr2的核苷酸序列如seq id no:61所示，编码所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2的重链cdr3的核苷酸序列如seq id no:62所示。

19.如权利要求16所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2，其特征在于，编辑所述中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2轻链的核苷酸序列如seq id no:63所示，编辑所述中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2重链的核苷酸序列如seq id no:64所示。

20.如权利要求16-19任意一项所述的中和猴痘病毒的人源单克隆抗体a29l-1a2在制备检测猴痘病毒的产品中的应用。

技术总结本发明涉及猴痘病毒人源单克隆抗体及其应用，通过筛选全人抗体人源化小鼠抗A29L特异结合的记忆B细胞，获得的人源高中和活性的猴痘病毒抗体A29L‑1B3、A29L‑1B2、A29L‑1A5和A29L‑1A2，具有与猴痘病毒结合能力强、体外中和性好、亲和力大、具有体内保护作用的特点，与已经报道的猴痘病毒抗体序列完全不同，为猴痘病毒的检测、中和提供了产品，为提供具有体内保护作用的猴痘病毒产品提供了可能。技术研发人员：高福,李燕,王奇慧,雷蕾,刘雅文受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所技术研发日：技术公布日：2024/9/17