一种谷氨酸棒杆菌基因组进化的系统、连续进化方法及应用

本发明涉及生物，尤其是指一种谷氨酸棒杆菌基因组进化的系统、连续进化方法及应用。

背景技术：

1、由于控制复杂表型的遗传因素是一个“黑盒子”，使得基于已知的基因组组成合理设计理想表型变得困难。适应性实验室进化(ale)是基于细胞对不断变化的环境条件的适应，发生有利突变。但是由于dna复制的保真度，生物突变率很低，大约每10亿个复制的dna碱基中有一个突变，因此依靠基因组的自发突变进行实验室进化是一个漫长的过程。例如，利用设计的全自动重复批培养装置经过约10天，每天>100个批次的连续进化，才获得以乙醇为底物生长速率为0.15±0.01h-1的谷氨酸棒杆菌突变株。常规的实验室进化经过95天的连续进化才获得在ph＝5.6下具有显著生长优势的突变菌株。因此提高谷氨酸棒杆菌基因组的自发突变率有利于实验人员在短时间内获得期望表型的突变株。虽然一些传统的诱变技术，如物理或化学诱变、重离子辐照、大气和室温等离子体(artp)和基因组重组等，在一定程度上提高了突变率。然而，这些技术的突变位点限制和繁琐的操作限制了进化的“规模”、“深度”和“场景”。体内连续进化技术在体内运行时不依赖外界人工干预，使优势突变自发保留到下一代，将突变与筛选完美结合，快速获得理想表型。

2、解决全球资源和粮食短缺问题需要改变目前严重依赖含糖原料的工业生物制造模式。因此，人们正在深入研究获取替代碳源的新概念和新技术。为了在生产过程中实现可持续的物质循环，乙醇的优势在于它比甲醇等c1化合物处理起来更简单，并且更容易在发酵过程中作为碳源整合。工业上使用的底盘细胞谷氨棒状杆菌具有天然的乙醇代谢途径。乙醇首先通过nad+依赖的乙醇脱氢酶氧化为乙醛，然后通过nad+依赖的乙醛脱氢酶氧化为乙酸，最后，乙酸经醋酸激酶磷酸化，再经磷酸转乙酰酶激活辅酶a，生成乙酰辅酶a作为中心代谢中间体。然而，乙醇作为谷氨棒状杆菌的碳源使用目前受到其相对较低的耐受性的限制，高浓度乙醇之下使细胞的生长受到严重抑制。提高谷氨酸棒杆菌对乙醇的耐受性将是提高其底物利用效率的有效措施。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌基因组进化的系统、连续进化方法及应用，利用该方法获得乙醇耐受性显著提高的突变株。通过全基因组测序鉴定对提高谷氨酸棒杆菌乙醇耐受有贡献的基因和突变点。首次鉴定了cgl2467具有乙醛脱氢酶活性，通过分子动力学模拟和分子对接解析了l213w突变提高cgl2467酶活和热稳定性的机制。

2、本发明第一个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌基因组进化的系统，包括质粒载体骨架，所述质粒载体骨架上组装连接有胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列和谷氨酸棒杆菌dna解旋酶的核苷酸序列；所述胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列和谷氨酸棒杆菌dna解旋酶的核苷酸序列之间通过柔性linker的核苷酸序列连接；

3、所述胞嘧啶脱氨酶来源于七鳃鳗(petromyzon marinus)；所述胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述柔性linker的核苷酸序列如seq id no.5所示，氨基酸序列如seq id no.6所示。

4、在本发明的一个实施例中，所述谷氨酸棒杆菌dna解旋酶选自cgl0025、cgl0141、cgl0776、cgl0779、cgl0846、cgl0854、cgl0894、cgl1156、cgl1326、cgl1927和cgl2519中的任一种；所述谷氨酸棒杆菌dna解旋酶cgl0854的核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示。

5、在本发明的一个实施例中，所述质粒载体选自pxmj19、pdxw10和pec-xk99e中的任一种。

6、本发明第二个目的是提供所述的系统在提高谷氨酸棒杆菌鲁棒性和/或生物合成效率中的应用。

7、本发明第三个目的是提供一种基因工程菌，由所述系统转化宿主菌所得。

8、在本发明的一个实施例中，所述宿主菌为谷氨酸棒杆菌。

9、本发明第四个目的是提供所述基因工程菌在筛选获得高鲁棒性和/或生物合成效率的菌株中的应用。

10、本发明第五个目的是提供一种提高谷氨酸棒杆菌鲁棒性的连续进化的方法，根据目标对所述基因工程菌进行连续筛选和定向进化，获得高鲁棒性和/或生物合成效率的菌株；所述目标为增强对醇类的耐受性。

11、本发明第六个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌乙醇耐受突变株，通过所述的连续进化的方法得到；所述谷氨酸棒杆菌乙醇耐受突变株以谷氨酸棒杆菌atcc 13032为出发菌株，将出发菌株中醛脱氢酶的第213位氨基酸进行突变得到；所述醛脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.7所示。

12、在本发明的一个实施例中，所述出发菌株中醛脱氢酶的第213位氨基酸发生突变为：将出发菌株中醛脱氢酶的第213位亮氨酸突变为色氨酸。

13、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

14、本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌基因组进化的系统、连续进化方法及应用，该方法显著提高基因组突变率，并且可以将突变与筛选压力(生长压力)结合，在筛选过程中自发的保留有利突变至下一代进化，因此可在短时间内获得鲁棒性提高的突变株。本发明所述的提高谷氨酸棒杆菌鲁棒性的连续进化方法应用于进化乙醇耐受突变株，不需要复杂的实验装置，仅在336h(9代)之后便获得在含8-14％乙醇的培养基中具有显著生长优势的突变株，在13％乙醇浓度下，突变株ne-cg的生物量是野生型菌株的10.17倍。通过对突变株的全基因组测序，发现由cgl2467基因编码的醛脱氢酶的213位亮氨酸突变为色氨酸对提高谷氨酸棒杆菌乙醇耐受性具有重要作用。首次鉴定了cgl2467具有乙醛脱氢酶活性，l213w突变可以提高cgl2467的酶活和热稳定性，通过分子动力学模拟和分子对接解析了l213w突变提高cgl2467酶活和热稳定性的分子机制。

技术特征：

1.一种谷氨酸棒杆菌基因组进化的系统，其特征在于，包括质粒载体骨架，所述质粒载体骨架上组装连接有胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列和谷氨酸棒杆菌dna解旋酶的核苷酸序列；所述胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列和谷氨酸棒杆菌dna解旋酶的核苷酸序列之间通过柔性linker的核苷酸序列连接；

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌dna解旋酶选自cgl0025、cgl0141、cgl0776、cgl0779、cgl0846、cgl0854、cgl0894、cgl1156、cgl1326、cgl1927和cgl2519中的任一种。

3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述质粒载体选自pxmj19、pdxw10和pec-xk99e中的任一种。

4.权利要求1～3任一项所述的系统在提高谷氨酸棒杆菌鲁棒性和/或生物合成效率中的应用。

5.一种基因工程菌，其特征在于，由权利要求1～3任一项所述系统转化宿主菌所得。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为谷氨酸棒杆菌。

7.权利要求5或6所述基因工程菌在筛选获得高鲁棒性和/或生物合成效率的菌株中的应用。

8.一种提高谷氨酸棒杆菌鲁棒性的连续进化的方法，其特征在于，根据目标对权利要求5或6所述基因工程菌进行连续筛选和定向进化，获得高鲁棒性和/或生物合成效率的菌株；所述目标为增强对醇类的耐受性。

9.一种谷氨酸棒杆菌乙醇耐受突变株，其特征在于，通过权利要求8所述的连续进化的方法得到；所述谷氨酸棒杆菌乙醇耐受突变株以谷氨酸棒杆菌atcc 13032为出发菌株，将出发菌株中醛脱氢酶的第213位氨基酸进行突变得到；所述醛脱氢酶的氨基酸序列如seqid no.7所示。

10.根据权利要求9所述的谷氨酸棒杆菌乙醇耐受突变株，其特征在于，所述出发菌株中醛脱氢酶的第213位氨基酸发生突变为：将出发菌株中醛脱氢酶的第213位亮氨酸突变为色氨酸。

技术总结本发明涉及一种谷氨酸棒杆菌基因组进化的系统、连续进化方法及应用。基于DNA解旋酶在转录过程中解旋dsDNA，将胞嘧啶脱氨酶pmCDA1与DNA解旋酶融合，提高谷氨酸棒杆菌的基因组突变率。应用本发明的连续进化方法提高谷氨酸棒杆菌的乙醇耐受性，获得在13％乙醇浓度下生物量提高10.17倍的突变株。通过全基因组测序鉴定出编码醛脱氢酶的Cgl2467基因的L213W突变对谷氨酸棒杆菌乙醇耐受性提高具有重要作用，并首次鉴定了Cgl2467具有乙醛脱氢酶活性。本发明公开的连续进化方法对筛选其他鲁棒性增强的突变体具有重要指导意义，本发明鉴定的乙醛脱氢酶有助于对谷氨酸棒杆菌乙醇代谢有新的认识。技术研发人员：徐美娟,饶志明,王晴,李懿琛,邵明龙,张显受保护的技术使用者：江南大学技术研发日：技术公布日：2024/9/17