一种水稻抗纹枯病基因qSbr12的分子标记及其应用和基因分型方法与流程

本发明涉及分子标记和水稻育种，特别是涉及一种水稻抗纹枯病基因qsbr12的分子标记及其应用和基因分型方法。

背景技术：

1、水稻(oryza sativa l.)是发展中国家的重要农作物，是数十亿人的主食。水稻纹枯病(rhizoctoniasolani)是一种极具破坏性的水稻病害，在世界范围内预计每年使水稻减产5％～10％，在发病严重的田块，纹枯病减产幅度在20％～42％。相较于化学防控，使用抗病品种是控制纹枯病最经济、有效、环保的措施。对保证我国水稻稳产和粮食安全具有重要意义。

2、水稻对纹枯病的抗性是受多个基因控制的数量性状。迄今为止，从定位的纹枯病qtl中没有发现值得用于育种或遗传工程的候选基因。因此，利用新的抗纹枯病种质资源进行qtls的定位研究可以极大地加快重要抗性基因的定位或克隆，有助于定向培育综合性状优良的抗病品种。针对特定qtl区间设计特有的分子标记，特别在辅助选择育种(mas)中，具有显著优势。它们通过直接识别与目标性状相关的qtl，提高选择效率，并允许在早期发育阶段筛选出目标性状个体，从而缩短育种周期，加快育种进程。

3、kasp技术(kompetitiveallele specific pcr)是一种基于竞争性等位基因特异性pcr的基因分型技术，广泛应用于植物育种、动植物基因组研究、疾病研究和药物开发。其关键点在于通过特异性引物设计，利用末端等位基因特异性碱基区分单核苷酸多态性(snp)，在pcr反应中结合模板dna并释放荧光信号，通过竞争性扩增提高检测准确性，仅完全匹配的引物能被扩增。kasp技术适用于高通量和自动化处理，能够快速处理大量样本，显示出良好的重复性和稳定性。与传统的ssr标记、indel标记和snp标记相比，kasp技术在特异性、经济效益、高通量处理、重复性和广泛应用性方面具有明显优势。它操作简便、成本较低，不需高通量测序设备，非常适合大规模筛选和遗传变异筛选，帮助选育抗病、抗逆、高产的新品种。

4、例如，cn202410403656.1公开了一种与小麦赤霉病抗性相关的kasp引物组及其应用,该kasp引物组可针对位于小麦3a染色体上的分子标记kfhb-3a进行基因型鉴定,从而提高抗赤霉病育种效率；cn201910209133.2公开了一种水稻抗稻瘟病广谱基因pi9的kasp分子标记及其检测方法和应用，利用kasp检测技术可快速鉴定水稻品种中的pi9基因,操作方便,检测结果准确可靠,适用于水稻pi9基因的鉴定及辅助育种,解决了传统选育效率低、育种周期长的难题。但现有技术中尚未发现采用kasp技术进行水稻纹枯病分子标记辅助选择的研究。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种水稻抗纹枯病基因qsbr12的分子标记及其应用和基因分型方法，本发明可以对水稻种质资源和育种子代在苗期进行抗病基因型筛选，淘汰携带感病基因型子代植株，大大提高水稻抗病育种效率。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供一种水稻抗纹枯病基因qsbr12的分子标记，所述分子标记包括qsbr12-09分子标记和/或qsbr12-10分子标记；

4、所述qsbr12-09分子标记的物理位置位于水稻12号染色体chr12_4510467，该位点为t时，为抗病等位基因，该位点为c时，为感病等位基因；

5、所述qsbr12-10分子标记的物理位置位于水稻12号染色体chr12_4583178，该位点为c时，为抗病等位基因，该位点为a时，为感病等位基因。

6、本发明还提供了一种扩增上述技术方案所述分子标记的引物，所述qsbr12-09分子标记的引物包括上游分型引物lsf_09_3-f1、上游分型引物lsf_09_3-f2和下游通用引物lsf_09_3-r；

7、所述上游分型引物lsf_09_3-f1的核苷酸序列如seq id no.1所示；

8、所述上游分型引物lsf_09_3-f2的核苷酸序列如seq id no.2所示；

9、所述上游分型引物lsf_09_3-r的核苷酸序列如seq id no.3所示；

10、所述qsbr12-10分子标记的引物包括上游分型引物lsf_10_2-f1、上游分型引物lsf_10_2-f2和下游通用引物lsf_10_2-r；

11、所述上游分型引物lsf_10_2-f1的核苷酸序列如seq id no.4所示；

12、所述上游分型引物lsf_10_2-f2的核苷酸序列如seq id no.5所示；

13、所述上游分型引物lsf_10_2-r的核苷酸序列如seq id no.6所示。

14、本发明还提供了上述技术方案所述的分子标记或上述技术方案所述的引物在水稻种质资源筛选中的应用。

15、本发明还提供了上述技术方案所述的分子标记或上述技术方案所述的引物在水稻种质资源鉴定中的应用。

16、本发明还提供了上述技术方案所述的分子标记或上述技术方案所述的引物在水稻分子标记辅助育种中的应用。

17、本发明还提供了一种利用上述技术方案所述引物进行水稻基因分型的方法，包括以下步骤：

18、1)提取待测水稻品种的基因组dna，以所述基因组dna为模板利用上述技术方案所述引物进行pcr扩增，得到扩增产物；

19、2)获取步骤1)得到的扩增产物的荧光信号结果，当只检测到6-羧基荧光素的荧光信号时，则待测水稻品种为抗纹枯病基因型；

20、当只检测到六氯-6-甲基荧光素的荧光信号时，则待测水稻品种为感纹枯病基因型；

21、若同时检测到两种荧光信号，则待测水稻品种为杂合基因型。

22、优选的，所述步骤1)pcr扩增的体系为：2×pcrmix 5μl、浓度为10μm的上游分型引物f10.1μl、浓度为10μm的上游分型引物f20.1μl、浓度为10μm的下游通用引物r 0.3μl，基因组dna 2μl、无酶ddh2o 2.5μl。

23、优选的，所述pcr扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s、55～61℃退火/延伸60s，共10个循环；95℃变性20s、55℃退火/延伸60s，共30个循环。

24、本发明的有益效果为：

25、(1)本发明利用连锁kasp分子标记及其引物序列与试剂盒，在种子或苗期检测育种材料的抗纹枯病qtl区间的等位基因型，预测其抗纹枯病能力并进行准确筛选，无需进行纹枯病接种和鉴定，从而提升抗纹枯水稻品种的遗传改良效率。

26、(2)该方法简便快捷，仅需pcr检测，检测过程无需使用的eb或者聚丙烯酰胺等对人体和环境有害的试剂。

27、(3)该方法适用于高通量和自动化处理，显示出良好的重复性和稳定性。kasp技术比传统ssr标记、indel标记和snp标记更具特异性、经济效益和广泛应用性，成本低，适合大规模筛选。