一种基于AIE型三联吡啶衍生物的近红外二区稀土钕配合物的制备方法

本发明涉及一种基于aie型三联吡啶衍生物的近红外二区稀土钕配合物的制备方法，属于有机合成。

背景技术：

1、荧光探针是光学成像技术最重要的载体。近几年，虽有多种类型的荧光探针被开发，如有机染料、量子点、半导体聚合物纳米粒子等，但这些荧光探针在稳定性、生物安全性等方面仍存在着各自问题，限制了其进一步的生物应用。相比之下，稀土配合物发光材料具有光稳定性好、stokes 位移大、发射带窄、毒性低、发光颜色和寿命可调等独特优势，是其他荧光材料所无法比拟的。因此，开发新型高效稀土发光材料，不仅有助于促进光学成像技术的发展，也符合国家的技术研发新趋势。

2、常用的有机配体有三联吡啶、吡啶、邻菲罗啉等，其中三联吡啶及其衍生物具有丰富的配位能力，分子中含有三个氮原子，作为三齿配体，能够与多种稀土金属形成稳定的配合物，其独特的非辐射跃迁过程和低量子产率，使其在超分子化学、材料科学以及配位化学中得到了充分的发展。4′位带有官能团的三联吡啶配体，已经被证明是有益的，它们能够表现出对过渡金属以及稀土金属具有很强的螯合作用和结合能力。三联吡啶配体固有的刚性结构能够有助于它们在生物相互作用中的适用性，相互连接的吡啶环赋予了生成络合物的稳定性，即使在苛刻的生物环境中也能保持其完整性。大量三联吡啶及其金属配合物所表现出来的发光性质使其在生物应用方面具有重要的应用价值，如细胞成像、传感等。例如deka等人的工作表明，三联吡啶-铜配合物对于线粒体具有特定的亲和力，它们能够提高线粒体内ros水平，并诱导氧化应激，进而诱发细胞凋亡途径。然而值得注意的是，与络合物相比，未络合的三联吡啶配体通常表现出较低的活性，而络合后活性普遍升高，这突出了中心金属对于其活性的巨大贡献。

3、但是，三联吡啶分子在聚集态下易发生π-π堆积而导致光捕获能力变弱和聚集发光猝灭（acq）现象，严重影响稀土卟啉配合物发光亮度，限制其生物成像应用。“聚集诱导发光（aie）”现象，从根本上解决了传统有机发光分子的acq问题，在生物荧光成像领域展现出诱人的应用前景。近期，徐海兵课题组报道了一种基于aie分子四苯乙烯（tpe）修饰的二联吡啶为配体的高亮度nir稀土配合物[(l)2-nd(no3)3]，该研究表明：当在配体中引入的tpe敏化单元越多，nd3+在近红外区发光量子产率越高。这启示我们：通过在三联吡啶配体上连接aie敏化单元，形成基于aie-fret的新型aie三联吡啶配体，再利用“天线效应”将由聚集诱导的发射能量传递给稀土离子，是提高稀土三联吡啶配合物发光亮度的一种有效方法。迄今为止，此方面的研究鲜有报道。因此，开发一种富含aie活性敏化单元的新型近红外二区（near infrared ii，nir-ii， 1000-1700 nm）稀土三联吡啶配合物具有重要的科学与经济价值。

技术实现思路

1、本发明通过在三联吡啶分子上键合tpa敏化单元的策略，开发一类具有aie活性的新型稀土三联吡啶配合物，提高可见光及nir-ii稀土配合物荧光量子产率，实现其高灵敏度、高分辨率和高信噪比的深层组织荧光成像。

2、一、稀土三联吡啶nd配合物（sh-nd）的制备

3、1）3n的合成

4、取4-溴苯甲醛、2-乙酰基吡啶和氢氧化钠共溶于甲醇-氨水体系中，升温至70~90℃回流反应48~72h，之后冷却至室温，继续搅拌3~4h，过滤收集固体，使用乙醇重结晶得到3n粉末；

5、所述4-溴苯甲醛与2-乙酰基吡啶的摩尔比为1：2~1：3，2-乙酰基吡啶与氢氧化钠的摩尔比为2：1~3：1。甲醇与氨水的体积比为4：1~5：1。

6、2）stpa-3n的合成

7、取上述合成的3n粉末与4-(二苯基胺基)苯硼酸和k2co3共溶于甲苯水溶液中，在氩气保护下，以四(三苯基膦)钯为催化剂，升温至70~90 ℃反应20~25 h，反应结束后，冷却到室温，使用二氯甲烷萃取，饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，除去溶剂后，柱分离得到stpa-3n；

8、所述3n粉末与4-(二苯基胺基)苯硼酸的摩尔比为1：1~1：2，4-(二苯基胺基)苯硼酸和k2co3的摩尔比为1：2~1：3。3n粉末与四(三苯基膦)钯的摩尔比为1：1~1：2。

9、3）sh-nd的合成

10、取乙酸钕和2-噻吩甲酰三氟丙酮（htta）共溶于乙醇-四氢呋喃体系中，在室温下搅拌反应3~4后，加入上述合成的stpa-3n，升温至60~80 ℃反应8~12 h，反应结束后，冷却至室温，抽滤，洗涤，干燥，即得sh-nd。

11、所述2-噻吩甲酰三氟丙酮与乙酸钕的摩尔比为2：1~3：1，stpa-3n与乙酸钕的摩尔比为1：1~1：2。乙醇与四氢呋喃的体积比为4：1~5：1。

12、本发明的合成路线：

13、

14、二、配合物的结构表征

15、1、配合物的红外光谱

16、stpa-3n属于三联吡啶的一种衍生物，具有较大的π共轭结构，其分子中的氮原子能与稀土元素结合，从而形成稀土配合物。因此可以通过配位前后分子的红外特征峰来判断其是否生成。图1是配位前stpa-3n和配位后sh-nd的ir光谱图。如图所示，配位前，在stpa-3n的红外谱图中，3058 cm-1、3030 cm-1、1586 cm-1、1480 cm-1、1381 cm-1、1330 cm-1处的吸收峰可归属于其分子上三联吡啶环的伸缩振动峰。而当stpa-3n与稀土离子nd3+发生配位后，上述特征峰均出现一定程度的移动。其中在sh-nd分子中，可以看到在3408 cm-1出现一个宽峰，这是由于配合物中聚丙烯酸中含有大量的羧酸基团导致。同时，在3056 cm-1、1625 cm-1、1590 cm-1、1480cm-1、1423 cm-1以及1303 cm-1和726 cm-1处出现相应的吡啶环、羰基以及c-s键的特征吸收峰，证明sh-nd的成功合成。

17、2、配合物的xps

18、如图2a所示，与配位前stpa-3n相比，配位后的sh-nd中出现了nd-3d和stpa-3n-nd的峰，这表明nd3+已经成功的配位到了stpa-3n分子上。由图2（b-d）及表1数据可知，配位前后stpa-3n和htta的c元素、htta的s元素以及f元素结合能基本保持不变，但n、o元素发生了明显的变化，这进一步证明了nd3+是与配体中的n、o元素发生了配位。同时，可以观察到配位前后n、o元素的结合能发生了一些变化。其中，在配位前后相应的c=o键的结合能升高了1.37 ev，c-n键的结合能升高了1.50ev，进一步证明配体中的n、o元素与稀土元素nd3+发生了配位。此外，在sh-nd的xps能谱中出现了位于985.08 ev、1009.38 ev和122.18 ev的峰，分别对应于nd(3d5/2)、nd(3d3/2)和nd(4d)，这进一步证明了配合物sh-nd的生成。

19、表1 未发生配位前stpa-3n、htta和配位后sh-nd的结合能变化

20、

21、3、配合物的形貌

22、如图3所示为sh-nd的sem扫描图像，由图可知，sh-nd的微观形貌为微米级大小不一的长方形条状结构。同时通过sem-mapping对选择区域进行元素分析，可以在稀土配合物sh-nd中观察到c、n、o、f、s、nd等元素的存在，且分布均匀。尤其是nd元素的存在和均匀分布，进一步证明了配合物sh-nd的成功制备。

23、三、配合物的性能评价及应用探究

24、1、stpa-3n的光学性质

25、首先研究了小分子配体stpa-3n的光学性质。图4a为stpa-3n在不同溶剂中的紫外-可见吸收光谱。由图可知，stpa-3n随着溶剂极性的逐渐增强，最大吸收峰位置基本没有发生改变，从极性最小的正己烷逐渐过渡到极性最大的mecn，其紫外吸收峰位移不超过8nm。其中，在thf溶液中，其紫外吸收峰位于308和354 nm处，分别对应分子中的π-π*和n-π*跃迁。图4b为在thf溶液中的荧光光谱，由图可知，stpa-3n的最佳激发位于365 nm，最佳荧光发射峰位于465 nm。此外，我们进一步研究了stpa-3n在不同溶剂中的荧光发射变化。与紫外吸收光谱不同，stpa-3n的荧光发射光谱发生了显著变化（如4c所示）。常用有机溶剂如静电介电常数和折光率等相关参数以及stpa-3n在这些溶剂中所测得的光谱数据详细列于表2中。由表可知，stpa-3n随着溶剂极性从弱极性的n-hexane到强极性的dmso，相应的荧光发射光谱波长从403 nm红移至528 nm。同时，荧光量子效率从甲苯中的15.8%降低至0.04%。图4d为不同溶剂中的归一化发射光谱图，由图能够更加清晰的观察到随着溶剂极性的增加，stpa-3n发生了近125 nm的红移，并导致斯托克斯位移的增大。这可能是因为stpa-3n分子独特的d-a结构，分子中具有高度极化的ict激发态所造成。

26、表2 stpa-3n在不同溶剂中的光学性质

27、

28、注：εa：溶剂的介电常数。ηb：折射率。 δfc：定向极化率。λemd：最大发射波长。qye：相对荧光量子产率（以硫酸奎宁的硫酸溶液作为标准）。

29、为了能够更好的理解溶剂极性与stpa-3n光学性质之间的关系及影响规律，我们采用lippert-mataga图表分析法，绘制出荧光发射的stokes位移与溶剂极性之间的关系曲线（图5所示）。由图可知，stpa-3n表现出良好的响应能力和线性关系（相关系数为0.9597）。lippert- mataga方程表示如下：

30、    （1）

31、                （2）

32、上述方程中的字母含义如下，µg和 µe表示处于基态和激发态的偶极距；h为普朗克常数，c为光速，a为onsager半径，n和ε分别代表介质的折射率和介电常数，δ v表示stokes位移； va和 ve代表化合物紫外最大吸收处和荧光最大发射处的波数；δ f表示溶剂的极性。

33、2、stpa-3n的aie性质

34、tpa是典型的aie分子，为了验证stpa-3n分子是否具有aie特性，采用将n-hexane（不良溶剂）加入到thf（良性溶剂中），测试了stpa-3n在不同正己烷含量的thf溶液中的荧光变化情况，如图6所示。相关测试结果表明，stpa-3n溶液荧光强度的增加与正己烷体积分数的增加并不成线性关系，这与聚集诱导荧光增强（aiee）现象是相似的。将stpa-3n分子溶于良性溶剂thf中，发出较弱的荧光，但当n-hexane加入时，由于stpa-3n分子发生聚集，导致荧光增强，这主要是因为不良溶剂导致tpa中苯环的转动受阻所致，表明该聚合物分子具有良好的aie特性。此外，由图6a也能明显的观察到：随着n-hexane的不断加入，stpa-3n溶液的荧光峰发生了明显的蓝移现象，这主要是由于前述的stpa-3n的溶剂化效应导致的。

35、3、sh-nd的光学性质

36、图7a为sh-nd在thf溶液中的可见吸收光谱图。由图可知，sh-nd展现出两个强的吸收峰，分别位于570 nm和750 nm附近，显示了nd3+的f-f特征吸收。图7b为sh-nd在thf溶液中的荧光发射光谱图，由图可知，sh-nd在thf溶液的最强荧光发射峰位于1060 nm处，同时在1331 nm处出现一个较弱的荧光发射峰，两者均归属于稀土元素nd的特征发射峰，分别对应于nd3+的4 f3/2-4 i11/2和4 f3/2-4 i13/2跃迁。因此，sh-nd为一种nir-ii荧光探针。

37、此外，还探究了sh-nd的aie发光性能。图7c和7d为sh-nd在不同浓度下的荧光发射谱图，由图可知，随着溶液浓度的增加，sh-nd在1060 nm以及1330 nm处的荧光强度均发生明显的增强趋势，其中在2.5 mg/ml时的荧光强度是0.25 mg/ml的3.5倍，表现出典型的aie特性。因此，在配体中引入tpa结构的稀土配合物sh-nd是一种具有aie活性的nir-ii荧光探针，有望将其应用在生物成像中。

38、除此之外，我们通过设计如下的对比试验来验证aie性能对配体天线效应的增强效果。采用相同的实验条件，在其他配体不变的情况下，选择不含tpa的3n作为配体，合成稀土配合物3n-nd，在相同的条件下进行荧光测试。如图8所示，可以观察到aie型稀土配合物sh-nd比非aie型稀土配合物3n-nd在nir-ii区的发光更强，相同浓度下荧光强度增强至2.6倍。这一测试结果表明：当在配体三联吡啶分子中引入tpa基团后，有利于配合物发光效率的提升。这可能是因为在通常情况下，稀土元素nd3+的 f- f跃迁是受阻的，虽然加入配体3n后，可通过天线效应向nd3+泵发一定的能量，在一定程度上使nd3+发光得以增强，然而其泵发的能量相对较小，从而促使荧光增强有限。而在sh-nd分子中存在给电子体tpa，能够形成d-a结构，从而促使带隙间能量降低。另一方面，配体stpa-3n具有更大的π共轭体系，富含π电子，π电子的激发能量较低，与其他类型的转变相比π*的能量更低，能够在一定程度上促使π-π*转变。因此，stpa-3n分子在被光激发后，能够吸收能量从基态跃迁到s1态，进而以系间窜跃的方式转变为t1态。处于t1态的电子能够将能量转移给nd3+，nd3+吸收够能量后，能够促使其电子跃迁至s1态，处于s1态的电子会通过辐射跃迁的方式返回到s0态，释放出nd3+特有的荧光。这成功的证明了在配体中引入aie基元，可以有效增强其天线效应，尤其是在聚集状态下，获得发光效率更高的稀土配合物。我们通过稳态/瞬态荧光光谱仪fls1000对sh-nd的荧光寿命进行了研究（如图9所示），并通过公式计算得到sh-nd的荧光寿命为0.927 ms，表现出较长的荧光寿命。这可能是因为sh-nd中配体的存在，配体能够将足够能量传递给nd元素，从而促使nd元素吸收能量跃迁到激发态，另一方面由于稀土元素的激发态和基态的能级差较大，而且其非辐射跃迁消耗的能量较少，从而使得稀土元素由激发态回到基态时将大部分的能量通过荧光的形式耗散掉。因此，稀有机配合物的荧光寿命普遍高于有机分子，大多为微秒或者毫秒级别。

39、4、sh-nd的生物毒性研究

40、低细胞毒性是具有生物成像能力的多功能生物材料最关键的要求之一。因此，对样品的细胞毒性测试通过常规的mtt法进行。将宫颈癌细胞（hela）和胃癌细胞（mkn-45）首先移入离心管于1000 r/min下离心7 min，加入培养液使细胞处于104个/ml浓度，然后200μl/孔将样品加入到96孔板中，其边缘部分全部使用pbs填充，最后放入培养箱孵育。24 h后，吸去原培养基和pbs缓冲液，将含有不同浓度样品加入每个孔中。24 h后，再次加入配置好的20 μl mtt溶液，继续孵育4 h后，吸出培养基，向每孔中加入180 μl dmso，摇晃10 min溶解结晶物质。然后使用rt 6100酶标仪测定吸光度值，重复三次，计算细胞存活率，结果如图10所示。在所有浓度条件下，两种肿瘤细胞的存活率都在90%以上，表明对细胞具有较低的细胞毒性，有望应用于nir-ii细胞成像中。