一种鉴别山药种属的DNA条形码、引物组合物、试剂盒、方法及应用

本发明涉及物种鉴定领域，尤其涉及一种鉴别山药种属的dna条形码、引物组合物、试剂盒、方法及应用。

背景技术：

1、《中国药典》(2020版)规定：山药为薯蓣科薯蓣(dioscorea opposite thunb.异名dioscorea polystachya turcz.)的干燥根茎，目前中国市场上常见的“山药”除薯蓣外，还包括有褐苞薯蓣(dioscorea persimilis prain et burkill)、参薯(dioscorea alatalinn.)以及日本薯蓣(dioscorea japonica thunb.)等。山药在我国具有悠久的食用与种植历史，但由于缺乏对物种概念的清晰认识，一些品种在归属上模糊不清，导致我国山药种植的世代延续品种资源混乱，缺乏统一的品种分类标准成为一个突出问题。除此以外，随着山药市场的增长，一些不法商家为了牟取更多利益，常将大戟科木薯(manihot esculentacrantz)和旋花科番薯(ipomoea batatas lam.)等非山药成分掺杂到山药相关食品中，严重扰乱了山药市场的健康发展。因此，高效且准确地鉴定山药的种属不仅为山药种质资源的保护及开发利用奠定基础，也是维护山药市场稳定发展的必要。

2、传统的植物草药物种鉴定多仰赖鉴定者的经验和观察，我国过去基于园艺学、形态标记等的分类方法容易受到环境、栽培方法等因素的影响，具有一定的局限性。现代的dna分子鉴定技术直接对生物个体中特定dna序列进行分析，从而能够在分子水平上实现对生物种类的鉴定，该技术手段相较于传统鉴定和蛋白质鉴定，具有特异性强、准确率高等优势。

3、dna条形码是一段短而标准的dna序列，物种间的dna都具有较高的保守性和较高的遗传多样性，使其在分子水平上的物种鉴定具有很大的优势。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种鉴别山药种属的dna条形码、引物组合物、试剂盒、方法及应用，提供了扩增薯蓣属物种及外类群的rbcl、matk、psba-trnh dna片段的引物对，能够对山药样品基因组dna进行特异性扩增，获得rbcl、matk、psba-trnh序列，通过与本发明提供的rbcl、matk、psba-trnh dna条形码标准序列依次进行比对，能够区分鉴定出山药的薯蓣属物种及外类群来源。该发明操作简单，准确率高，能够快速鉴定出山药的种属来源，为山药品种的鉴定以及遗传改良提供了保障。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：一方面，提供了一种鉴别山药种属的dna条形码，该dna条形码的核苷酸序列包括rbcl、matk和psba-trnh；所述rbcl序列如seq id no.7所示；所述matk序列如seq id no.8所示；所述psba-trnh序列如seq id no.9、seq idno.10所示。

3、提供了一种用于扩增上述的dna条形码的引物组合物，所述引物对的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如下所示：

4、所述rbcl序列的引物对：

5、正向引物rbcl-f：5’-tatcttagcgccattccgagta-3’(seq id no.1)；

6、反向引物rbcl-r：5’-cgcggataatttcattaccttc-3’(seq id no.2)；

7、所述matk序列的引物对：

8、正向引物matk-f：5’-caggagtatatttacacac-3’(seq id no.3)；

9、反向引物matk-r：5’-gcaggtcattgatacagat-3’(seq id no.4)；

10、所述psba-trnh序列的引物对：

11、正向引物psba-trnh-f：5’-gttatgcatgaacgtaatgctc-3’(seq id no.5)；反向引物psba-trnh-r：5’-cgcgcatggtggattcacaatcc-3’(seq id no.6)。

12、提供了一种用于鉴别山药种属的试剂盒，其包含上述的引物组合物。

13、又提供了一种用于鉴别山药种属的方法，包括以下步骤：

14、a)提取待测山药样品的基因组dna序列；

15、b)以提取的山药基因组为模板，基于权利要求2所述的引物对进行pcr扩增，得到rbcl、matk和psba-trnh的pcr产物，对所得pcr产物进行测序，得到pcr产物各自的dna序列，即rbcl、matk和psba-trnh的序列；

16、c)权利要求1所述dna条形码中的rbcl(seq id no.7)、matk(seq id no.8)和psba-trnh(seq id no.9、seq id no.10)条形码序列为标准序列，将步骤b)所得待测序列rbcl、matk和psba-trnh与所述标准序列依次进行序列同源性比对，根据比对结果能够有效地鉴定出待测山药样品的种属(包括d.polystachya、d.japonica、d.persimilis、d.bulbifera、d.alata、d.cirrhosa、d.nipponica、d.zingiberensis以及外类群m.esculenta或i.batatas)。

17、其中，所述pcr扩增的程序为：1)95℃预变性3分钟；2)95℃变性10秒，50℃-70℃退火15秒，72℃延伸x分钟(x为延伸时间，根据目的基因的长度决定，1分钟延伸1000bp)，共30个循环；3)72℃终延伸10分钟。

18、进一步地，pcr扩增的rbcl序列长度为1400-1600bp，pcr扩增的matk序列长度为1500-1700bp，pcr扩增的psba-trnh序列长度为350-500bp。进一步地，在步骤c)中，将步骤b)所得rbcl序列与seq id no.7-rbcl dna条形码标准序列进行序列同源性比对，相似度低于98％，则该序列对应的样品不属于薯蓣属物种，该序列应来自山药常用伪品外类群m.esculenta和i.batatas；若相似度大于或等于98％，则该序列对应的样品属于薯蓣物种，需与本发明提供的其他dna条形码标准序列继续比对；将待鉴定薯蓣种属样品的matk序列与seq id no.8-matk dna条形码标准序列进行比对，当相似度大于或等于98％，并且在seqid no.8-matk dna条形码标准序列对应的第54bp、110bp、120bp、220bp及1027bp处的碱基分别显示为t、a、g、g、g，则该序列对应的样品种属为d.polystachya；若在seq id no.8-matk dna条形码标准序列对应的第54bp、110bp、120bp、220bp及1027bp处的碱基分别显示为t、a、a、a、g，则该序列对应的样品种属为d.japonica；若在seq id no.8-matk dna条形码标准序列对应的第54bp、110bp、120bp、220bp及1027bp处的碱基分别显示为t、c、g、a、g，则该序列对应的样品种属为d.persimilis；若在seq id no.8-matk dna条形码标准序列对应的第54bp、110bp、120bp、220bp及1027bp处的碱基分别显示为c、c、g、a、t，则该序列对应的样品种属为d.bulbifera；若在seq id no.8-matk dna条形码标准序列对应的第220bp、536bp、900bp及926bp处的碱基分别显示为a、g、c、g，则该序列对应的样品种属为d.alata；

19、将剩余待鉴定种属样品的psba-trnh序列与seq id no.9-psba-trnh dna条形码标准序列进行比对，如果相似度大于或等于98％，则该序列对应的样品应为d.cirrhosa，如果相似度小于98％，则将未鉴定出种属的样品的psba-trnh序列与seq id no.10-psba-trnh dna条形码标准序列进行比对，如果相似度大于或等于96％，则该序列对应的样品应为d.nipponica，如果相似度大于80％且小于96％，则该序列对应的样品应为d.zingiberensis。

20、最后，提供了上述dna条形码在鉴别山药的薯蓣属物种及外类群中的应用。提供了上述引物组合物在鉴别山药的薯蓣属物种及外类群中的应用。提供了上述试剂盒在鉴别山药的薯蓣属物种及外类群中的应用。

21、本发明的有益效果在于：

22、本发明提供了扩增薯蓣属物种及外类群的rbcl、matk、psba-trnh dna片段的引物对，可以对山药样品基因组dna进行特异性扩增，获得rbcl、matk、psba-trnh序列，通过与本发明提供的rbcl、matk、psba-trnh dna条形码标准序列依次进行比对，能够区分鉴定出山药的薯蓣属物种及外类群来源。该发明操作简单，准确率高，可以快速鉴定出山药的种属来源，为山药品种的鉴定以及遗传改良提供了保障。

23、另外，本发明首次利用rbcl+matk+psba-trnh的条形码组合建立了山药种属的鉴定方法。通过将待鉴定样品的rbcl、matk、psba-trnh条形码与本发明提供的dna条形码标准序列依次进行比对，能够有效且快速地区分鉴定出常见的山药薯蓣属物种(包括d.polystachya、d.japonica、d.persimilis、d.bulbifera、d.alata、d.cirrhosa、d.nipponica、d.zingiberensis)和山药伪品的外类群来源(m.esculenta或i.batatas)，不受环境地域影响，无需熟悉山药的形态特性，为山药品种的鉴定以及遗传改良提供了保障。

24、本发明提供了一种用于山药种属鉴定的试剂盒，其包括上述pcr扩增所用引物，可以快速鉴定出山药的种属来源，为山药品种的鉴定以及遗传改良提供了保障。