一种用于人CD19+B细胞分离的适配体及其试剂盒的制作方法

本发明涉及生物领域，具体为一种用于人cd19+b细胞分离的适配体及其试剂盒。

背景技术：

1、cd19是一种95kd的跨膜糖蛋白，仅在b淋巴细胞上表达，属于免疫球蛋白超家族成员，是b细胞抗原受体信号转导的关键共受体。cd19与b细胞抗原受体的共连接可协同促进钙释放、丝裂原活化蛋白激酶活性和细胞增殖。cd19在超过90％的急性淋巴细胞白血病患者的白血病细胞表面表达。还可在b细胞nhl和慢性淋巴细胞白血病的肿瘤细胞上表达。因此，cd19抗原是b细胞恶性肿瘤免疫治疗的理想靶点。cd19可以作为b细胞共受体与cd21和cd81结合。遗传学研究表明，cd19在维持免疫反应和自身免疫之间的平衡中发挥作用。虽然cd19和cd22都有自己的调节网络，但它们并不独立调节b细胞受体信号。cd19通过增加lyn激酶活性调节cd22磷酸化，而cd22通过sh蛋白酪氨酸磷酸酶-1(shp-1)抑制cd19磷酸化。这种“cd19/cd22环”可能与小鼠自身免疫表型直接相关，因此它可能是调节自身免疫性疾病中b细胞信号传导的一个有吸引力的治疗靶点。

2、目前，从血细胞中分离富集cd19+b细胞的方法主要采用cd19抗体的免疫磁珠法。该方法首先将抗体连接到磁珠上，然后将偶联有抗体的磁珠对目标细胞进行捕获、富集和磁性分离。由于抗体直接偶联于磁珠上，常常会导致抗体的活性降低并且引起抗体的空间方向发生改变，增大了抗体间的空间位阻效应，从而降低抗体的捕获效率。其次，磁珠偶联抗体时，一般采用疏水或强亲水基团，容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。

3、适配体方法是近年发展起来的一种技术，该方法从核酸文库中通过配体指数富集(selex)系统进化的迭代选择-扩增过程鉴定与目标分子高亲和力的分子。与抗体相比，适配体筛选周期短，容易通过化学合成获得，与靶分子的亲和力高，性质更稳定，在分子生物学和医学中的应用广泛。虽然selex通常使用纯化的靶分子筛选适配体，但活细胞也可作为选择靶标。这种cell-selex技术有几个优点。例如，筛选出来的适配体识别活细胞膜上目标分子的原生构象，克服了难表达纯化的细胞跨膜蛋白作为选择靶标的问题。此外，在不了解靶细胞表面分子的情况下，也可以获得识别细胞的特异性适配体。本发明筛选得到一种能高效特异性结合人cd19+b细胞的适配体。该适配体与靶细胞的亲和力高，生产成本低廉，以该适配体为基础可以制备成特异性筛选和富集人cd19+b细胞的试剂盒。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于人cd19+b细胞分离的适配体及其试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种用于人cd19+b细胞分离的适配体，包括以下适配体序列：

4、sequence1：

5、tagggaagagaaggacatatgatgcaggcgggtctcagcgttctac cgaattaatccacgaggttgactagtacat gaccacttga

6、sequence2：

7、tagggaagagaaggacatatgatatcccagaacggtaaacgaaag agccggccgtatattcgtttgactagtacat gaccacttga

8、sequence3：

9、tagggaagagaaggacatatgatttatccggtcctagcatgtacaac tcgggtccgtaagcgtttgactagtacat gaccacttga

10、sequence4：

11、tagggaagagaaggacatatgatcaatcaaatattgacgcgagggc gactaagcgggatacatttgactagtacat gaccacttga

12、sequence5：

13、tagggaagagaaggacatatgattaggacctgaggctgacatttat aattagtcgtggttcatttgactagtacat gaccacttga

14、sequence6：

15、tagggaagagaaggacatatgatcggcacatgggctcccacacgct gcgcgctgtaatgtgtcttgactagtacat gaccacttga

16、sequence7：

17、tagggaagagaaggacatatgatcaactttacattatacccttctct ccgtcgcgcaggcaatttgactagtacat gaccacttga

18、sequence8：

19、tagggaagagaaggacatatgatttgtgtaaatcgccgctgctttg agacatgtacgcaatttttgactagtacat gaccacttga

20、sequence9：

21、tagggaagagaaggacatatgatgctttcgccaaggcatatatgcg gcagataagaaactagcttgactagtacat gaccacttga

22、sequence10：

23、tagggaagagaaggacatatgattagctaaccaacttccagacaccacgtcattcttgggtaattgactagtacat gaccacttga。

24、进一步的，包括用于扩增人cd19+b细胞适配体序列的引物组，所述引物组序列如下：

25、正向引物的序列：5’-tagggaagagaaggacatatgat-3’；

26、反向引物的序列：5’生物素-tcaagtggtcatgtactagtcaa-3’。

27、进一步的，将正向引物5’-tagggaagagaaggacatatgat-3’和反向引物5’生物素-tcaagtggtcatgtactagtcaa-3’进行pcr扩增后克隆入pmd19-t载体，转化dh5α细菌后进行菌落pcr鉴定阳性克隆后测序。

28、进一步的，采用核酸适配体的cell-selex筛选技术，以从人pbmc中分离得到的人cd19+b细胞为正性筛选靶标，以去除cd19+b细胞后人pbmc细胞为负性筛选细胞，筛选与人cd19+b细胞特异性结合的核酸适配体，制备特异性结合人cd19+b细胞的序列。

29、进一步的，所述pcr扩增的反应条件如下：

30、95℃初始变性10min，95℃变性30s；

31、45℃退火30s，每次pcr循环递增0.2℃；

32、72℃延伸1.5min，72℃最终延伸7min。

33、进一步的，所述人cd19+b细胞分选的适配体能够特异性结合人cd19+b细胞。

34、进一步的，所述人cd19+b细胞分选的适配体细胞来自人外周血单个核细胞。

35、进一步的，所述人cd19+b细胞分选的适配体序列应用，可进一步用于制备特异性分离人cd19+b细胞的试剂盒。

36、一种试剂盒，包括任一项所述适配体。

37、进一步的，使用amplitaq gold 360聚合酶试剂盒在eppendorfmastercyclernexus中扩增文库，通过在5'末端用生物素修饰的反向引物，使用链霉亲和素偶联磁珠从扩增的双链dna进行每轮连续选择，生成ssdna文库。

38、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

39、1、本发明获得了一种能特异高效结合人cd19+b细胞的适配体。该适配体能大量人工合成，方法简单，成本低廉，以该适配体为基础可以制备成特异性筛选和富集人cd19+b细胞的试剂盒；

40、2、本发明的适配体可以用于制备试剂盒，该试剂盒可以用于特异性分选人cd19+b细胞，分选得到的人cd19+b细胞纯度达到95％以上，细胞得率85％以上，且成本低廉，具有极强的应用价值。