一种环状RNA的检测方法及其在调控鸡肌肉发育中的应用

本发明属于畜禽分子育种领域，具体的，涉及一种参与肌肉生长发育的环状rnacircclasp2的检测方法及其在调控肌肉发育中的应用。

背景技术：

1、环状rna(circrna)是一类特殊的rna分子，在生物体内广泛存在，并在基因表达调控中扮演重要角色。相比于线性rna分子，环状rna更稳定，不易被rna酶降解。一般来说，circrna通过海绵吸附作用竞争性结合mirna，从而调节基因表达。此外，部分circrna具有开放阅读框，能够翻译出小肽和多肽，参与生命活动调节。还有一些circrna停留在细胞核中，参与基因的转录调控。

2、我国是肉鸡产业大国。近年来，我国的肉鸡消费水平显著提升，产量大幅增长，高品质的鸡肉供不应求。如何改善鸡肉品质，提高产肉量，增强优质鸡肉的自给能力，成为我国禽养殖业亟待解决的难题。动物的骨骼肌是人类主要的肉质来源。骨骼肌是由肌肉组织借助肌腱与骨骼相连形成的，胚胎期是鸡肉发育的关键时期,肌纤维的数量在胚胎期就已经确定。骨骼肌的发育状况直接影响肉鸡的肉类品质，进而影响肉鸡养殖业的经济效益。成肌细胞的增殖、分化和凋亡等是肌肉生长发育的基础，这个过程受到一系列复杂因素的调控，近年来的研究表明，circrna在机体生长发育中发挥重要作用，circrna在肌肉生长中的功能研究也多有报道，比如circlom7能够促进牛原代成肌细胞增殖，circfut10能够诱导牛原代成肌细胞分化，circzbtb10促进鸡成肌细胞的增殖和分化。

3、circclasp2来源于鸡的clasp2基因，clasp2基因位于2号染色体上，是细胞质连接蛋白家族的一员。clasp2基因参与多种生物学过程，主要通过影响微管的组装和去组装，从而在多种细胞发育过程中发挥作用，例如细胞迁移和细胞分裂，此外也有研究表明clasp2在维持造血干细胞(hsc)特性方面发挥作用，能够防止hsc的过早分化和维持hsc的自我更新。目前还未有鸡clasp2对肌肉生长调控方面的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供鸡环状rnacircclasp2的检测引物及该环状rna在调控肌肉发育中的应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种鸡环状rnacircclasp2的检测引物。

3、本发明的第二个目的是提供所述检测引物在检测所述circrna中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供用于过表达所述环状rnacircclasp2的产品或方法在调控鸡成肌细胞增殖和分化中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供所述鸡环状rnacircclasp2在促进鸡成肌细胞增殖和分化中的应用。

6、本发明的第五个目的是提供所述鸡环状rnacircclasp2在调控鸡肌肉发育中的应用。

7、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

8、本发明以目前产业养殖中多种品种的鸡为研究对象，具体的以快速生长型肉鸡和慢速生长型肉鸡为研究对象，此处分别以商品化白羽肉鸡(为快速生长型，产肉率高)和本土品种大围山微型鸡(慢速生长型，产肉率低)为实验对象。本发明提供了一种环状rna-circclasp2，所述circclasp2来源于鸡的clasp2基因，circclasp2由六个外显子组成，长度为588nt，其核苷酸序列如seq id no:1所示。与通用引物相比，随机引物对circclasp2具有较高的反转录效率，并且使用rna酶消化后，circclasp2水平变化不明显，说明circclasp2是一个不含poly(a)的环状结构分子。

9、circclasp2碱基序列(seq id no:1):

10、ttctcctgcctttgatagatcgtatgggagatgccaaagatcaagttcga

11、gagcaagcacagaatctcatattgaagttgatggatgaggcagcaccgc

12、ccatgtacatttgggaacgccttgctgttggttttaaacacaagaattac

13、cgatcccgagaaggagtgtgtttgtgtcttattgcaaccttaaacattta

14、tggtgcccagccgttaagtctcagcaagttggtaccacatctgtgtgca

15、gcatttggtgactcaaatagtcaggtgagagatgctgctatactagccat

16、tgtggaggtttatagacatgtgggggagaaagtacgactagaccttaca

17、aaaagaggaattcctcctgcaaggttgcaaacaatctttacaaaatttg

18、atgaagtgagagactctggaaatatgattttaagtaacatcagtgacaa

19、aagcttcgatgatgaagagtcggtggatggaaataggccatcgtcagca

20、gcttcagccttcaagattcctgcacctaaaaagccaggaaatccttcca

21、acagtgcaaggaagccgggttctgctggtgggccaaaggttggag

22、本发明发现上述由clasp2基因产生的circclasp2在4周龄的不同品种鸡的全身各个组织中都有表达，并且在白羽肉鸡的肌肉组织中高表达，而在大围山鸡的肌肉组织中低表达；circclasp2在白羽肉鸡的胚胎期的肌肉组织中呈现时序表达水平升高的趋势，在出生后略有下降；而在大围山鸡中，circclasp2的时序表达水平的变化不明显。

23、本发明通过使用plo5-cir质粒构建circclasp2的重组过表达载体并转染成肌细胞，在成肌细胞中过表达，并检测相关的增殖标记基因以及分化标记基因的表达水平，发现过表达circclasp2可以促进成肌细胞的增殖以及促进成肌细胞分化。

24、本发明首次发现鸡clasp2基因环状转录本circclasp2的存在，并发现其与肌肉发育密切相关，因此本发明要求保护以下内容：

25、本发明请求保护上述环状rnacircclasp2的荧光定量pcr引物，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no:2-3所示。

26、本发明请求保护环状rnacircclasp2在促进成肌细胞增殖分化中的应用，所述鸡环状rnacircclasp2的核苷酸序列如seq id no:1所示。

27、本发明请求保护含有鸡环状rnacircclasp2的重组载体在促进成肌细胞增殖分化中的应用，所述鸡环状rnacircclasp2的核苷酸序列如seq id no:1所示。本发明还请求保护用于过表达所述的环状rnacircclasp2的产品或方法在促进成肌细胞增殖分化中的应用。

28、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

29、本发明验证了clasp2基因的环状转录本circclasp2的存在，并克隆全长确定了环结构；本发明提供了一对检测circclasp2的荧光定量引物；本发明通过实验确定了circclasp2在不同种鸡的各个组织中都有表达，并且在白羽肉鸡的肌肉中的表达水平高于大围山地方鸡；本发明构建circclasp2的过表达载体并转染成肌细胞，发现过表达circclasp2后显著提高了增殖标记基因和分化标记基因的表达，促进成肌细胞的增殖和分化；本发明发现的鸡的环状rnacircclasp2在有关肌肉性状的鸡的分子育种中有很大的应用价值，为鸡的肌肉性状改良以及高产肉鸡的选育提供了一种新的研究方向。