快速大量扩增脂肪间充质干细胞的方法及得到的脂肪间充质干细胞与流程

本发明涉及脂肪间充质干细胞培养方法，尤其是从脂肪组织或抽脂物中分离的脂肪间充质干细胞、复苏培养的脂肪间充质干细胞、传代培养的脂肪间充质干细胞快速、大量扩增方法。

背景技术：

1、干细胞是目前生命科学领域备受关注的热点之一，因其自我更新和多向分化潜能，具有巨大的生物学潜力，自20世纪60年代开始，围绕干细胞的研究取得了重要的进展，并在基础科学研究、再生医学研究和药物研发等多领域有了广泛的应用。

2、干细胞主要分为胚胎干细胞、成体干细胞、还有诱导多能干细胞。其中成体干细胞广泛存在于各种成体组织和器官中，比如造血干细胞可以分化为各种血细胞，神经干细胞能够分化为神经细胞等。而脂肪间充质干细胞，来源于脂肪组织，具有多向分化潜能，能分化为多种细胞，由于其独特的来源和特性，逐渐成为干细胞研究与应用中的一个重要关注点。

3、脂肪组织广泛地存在于所有的哺乳动物以及部分非哺乳动物的体内，其主要的分布区域涵盖了皮下组织、腹膜内区域，同时也存在于多种极为重要的器官表面。

4、脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived stromal cells，adscs)是间充质干细胞的可用来源，具有适当的体外存活、繁殖和分化为外胚层、中胚层和内胚层三个谱系的细胞的能力。adsc的生物学特征取决于供体的生理和健康状况、分离程序、培养条件和所使用的分化方案。这种脂肪间充质干细胞是通过从血管基质片段(stromalvascularfraction，svf)中进行分离并提取而获得的。因其来源于脂肪组织，可以通过常规的吸脂术中获取。同时，具有免疫源性低、不涉及伦理问题等优势，获得了越来越多临床研究者的青睐。

5、adsc通过svf中存在的不同细胞群进行纯化，并在标准条件下培养，以产生高度丰富的干细胞资源，直接应用于临床或分化成多种细胞。然而，在目前条件下，长期传代会导致其干性减弱或者丢失，会影响临床治疗效果。在体外培养时间越长，细胞发生老化和氧化损伤积累的可能性就越大，细胞的增殖能力和归巢潜能有所减弱。因此，缩短在体外扩增时间，有助于提高其归巢性，可增强其临床效果。

6、在临床前以及临床研究的过程当中，关于常规分离、扩增以及分化等方法的深入开发与持续优化显得尤为重要。这是因为通过这些举措，可以更好地维持adsc所应具备的理想生物学功能。具体而言，在分离过程中，需要不断探索更精准、高效的技术手段，以确保能够获取纯度更高、质量更优的adsc；在扩增方面，要深入研究如何在更短时间内实现细胞数量的有效增加，同时避免对细胞特性产生不良影响；而在分化方法上，则要致力于找到更适宜的诱导条件和途径，促使adsc能更准确地朝着目标细胞类型分化。只有这样全方位地研究，才能使adsc在临床应用中发挥出最大的潜力，为医学研究和疾病治疗带来更多的希望和突破。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是从脂肪组织或抽脂物中分离的脂肪间充质干细胞、复苏培养的脂肪间充质干细胞、传代培养的脂肪间充质干细胞的快速、大量扩增。研究发现，脂肪间充质干细胞在基础培养基mem-α添加胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子的培养体系中，可维持生长，但扩增速度缓慢，添加血小板裂解物可提高细胞扩增速率，而在细胞完成贴壁前加入血小板裂解物，细胞贴壁效率降低，从而造成细胞扩增效率降低。本发明在细胞分离或接种初期添加含体积分数5-15％胎牛血清、终浓度100-200iu/ml碱性成纤维细胞生长因子的mem-α，分离细胞融合度达10％或接种细胞24-48后按照体积分数3-7％加入血小板裂解物，避免了血小板裂解物对细胞贴壁造成的影响，并且实现脂肪间充质干细胞的迅速大量扩增，获得高纯度的具有生物活性的脂肪间充质干细胞。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种快速大量扩增脂肪间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

3、(1)取脂肪间充质干细胞，用脂肪间充质干细胞培养基，重悬细胞沉淀，过滤，计数，根据计数结果，按照(2-3)×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加脂肪间充质干细胞培养基，放入培养箱中继续培养；细胞培养24-48小时后，按照3％-7％体积分数加入血小板裂解物，放入培养箱中培养，细胞培养至融合度达80％，用质量百分比浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入tryple消化液使细胞从培养瓶底部脱落，离心回收细胞；所述脂肪间充质干细胞培养基为mem-α培养基，培养基中含有体积分数5％-15％胎牛血清、终浓度100-200iu/ml碱性成纤维细胞生长因子；

4、(2)重复步骤(1)，进行脂肪间充质干细胞连续传代扩增。

5、所述脂肪间充质干细胞为新分离的脂肪间充质干细胞或冻存复苏后的脂肪间充质干细胞。

6、所述新分离的脂肪间充质干细胞的细胞分离包括以下步骤：

7、(1)取脂肪组织或抽脂物，用脂肪清洗液洗净后静置，吸取上层脂肪组织或抽脂物加入消化液在气浴恒温振荡器内振荡消化；消化完成后，加入脂肪间充质干细胞培养基，颠倒混匀后进行离心，离心后吸弃上层漂浮组织及上清液，再次加入脂肪间充质干细胞培养基轻吹底部沉淀至均匀重悬；取新的离心管，移液管再次吹打细胞悬液后将全部悬液过滤至新的离心管中，吹打混匀后接种至细胞培养瓶或培养皿中，放入培养箱中培养，所述脂肪间充质干细胞培养基为mem-α培养基，培养基中含有体积分数5％-15％胎牛血清、终浓度100-200iu/ml碱性成纤维细胞生长因子；

8、(2)显微镜下观察细胞融合度达10％，按照3％-7％体积分数添加血小板裂解物，放入培养箱中培养；

9、(3)半量或全量弃原培养上清，加入步骤(1)中的脂肪间充质干细胞培养基，按照3％-7％体积分数添加血小板裂解物，放入培养箱中培养；

10、(4)细胞培养至融合度达80％，用质量百分比浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入tryple消化液使细胞从培养瓶底部脱落，离心回收细胞。

11、所述冻存复苏后的脂肪间充质干细胞的细胞复苏包括：复苏冻存细胞，完全融化后加入37℃的脂肪间充质干细胞培养基中，吹打混匀后将细胞悬液转移细胞培养瓶或培养皿中，放入培养箱中培养；细胞培养24-48小时后，按照3％-7％体积分数添加血小板裂解物，放入培养箱中培养，细胞培养至融合度达80％，用质量百分比浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入tryple消化液使细胞从培养瓶底部脱落，离心回收细胞；所述脂肪间充质干细胞培养基为mem-α培养基，培养基中含有体积分数5％-15％胎牛血清、终浓度100-200iu/ml碱性成纤维细胞生长因子。

12、优选，新分离的脂肪间充质干细胞的细胞分离中步骤(1)为：取脂肪组织或抽脂物，用脂肪清洗液洗净后静置，吸取上层脂肪组织或抽脂物20ml加入到含有2ml消化液的离心管中，混匀后插入到预热至37℃的气浴恒温振荡器内，调整振荡频率为120rpm，振荡消化45min；消化完成后，每管加入10ml脂肪间充质干细胞培养基，颠倒混匀后，300-500g离心5-10分钟；离心后打开管盖，吸弃上层漂浮组织及上清液，每管加入30ml脂肪间充质干细胞培养基轻吹底部沉淀至均匀重悬；取新的离心管，移液管再次吹打细胞悬液后将全部悬液过滤至新的离心管中。吹打混匀后接种至细胞培养瓶或培养皿中，放入培养箱中培养；脂肪干细胞培养基为mem-α培养基，培养基中含有体积分数5％-15％胎牛血清、终浓度100-200iu/ml碱性成纤维细胞生长因子。

13、优选，所述冻存复苏后的脂肪间充质干细胞的细胞复苏包括：金属浴或水浴复苏冻存细胞，完全融化后加入至37℃的上述脂肪间充质干细胞培养基中，吹打混匀后将细胞悬液转移细胞培养瓶或培养皿中，放入培养箱中培养；细胞培养24-48小时后，按照3％-7％体积分数向培养体系中添加血小板裂解物，放入培养箱中培养，细胞培养至融合度达80％，用质量百分比浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入tryple消化液使细胞从培养瓶底部脱落，300-500g离心5-10分钟回收细胞。

14、优选，所述取脂肪间充质干细胞，用脂肪间充质干细胞培养基重悬细胞沉淀，过滤，计数，根据计数结果，按照(2-3)×104/cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加上述脂肪间充质干细胞培养基，放入培养箱中继续培养；细胞培养24-48小时后，按照3％-7％体积分数向培养体系中加入血小板裂解物，放入培养箱中培养，细胞培养至融合度达80％，用质量百分比浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入tryple消化液使细胞从培养瓶底部脱落，300-500g离心5-10分钟回收细胞，重复上述步骤进行脂肪间充质干细胞连续传代扩增。

15、所述脂肪清洗液为硫酸庆大霉素终浓度为80iu/ml的0.9％氯化钠注射液，所述消化液为1g/100ml的i型胶原酶。

16、所述培养箱为37℃，5％co2培养箱。

17、上述快速大量扩增脂肪间充质干细胞的方法及得到脂肪间充质干细胞。

18、本发明的有益效果在于，临床应用脂肪间充质干细胞通常为千万数量级以上，传统培养方法无法在短时间内满足扩增需求，而脂肪间充质干细胞的规模化生产是突破这一瓶颈的重要举措。本发明在分离细胞融合度达10％或接种细胞24-48小时后加入血小板裂解物，促进成纤维细胞集落形成和细胞数量增加，同时避免了血小板裂解物对细胞贴壁的影响，实现脂肪间充质干细胞体外快速、大量增殖，为脂肪间充质干细胞的研究提供基础。