一种提高积雪草酸C28-O葡萄糖糖基化修饰的方法

本发明涉及一种提高积雪草酸c28-o葡萄糖糖基化修饰的方法，属于酶工程。

背景技术：

1、积雪草苷(asiaticoside,as)属于五环三萜类化合物，分子式为c48h78o19，相对分子质量959.12，其分子结构中碳骨架为乌苏烷型。积雪草苷具有促进创伤愈合，神经保护，抗炎，抗病毒，抗糖尿病和保护心肌细胞等作用。积雪草苷是从伞形科多年生草本植物积雪草(centella asiatica(l.)urban)当中分离得到的，这种植物通常生长在日光充足且潮湿的环境中。积雪草苷的前体是积雪草酸，它作为一种重要的生物活性成分，具有多种生理功能和药理作用。1971年发现积雪草提取物能够治疗皮肤创伤后，科学家们对其开展了大量的研究，发现其主要活性成分积雪草酸对皮肤溃疡、疤痕、疙瘩、局限性硬皮病、皮肤淀粉样变性、萎缩性硬化性苔藓等一些皮肤病具有较好的治疗效果。后续又报道积雪草酸具有保肝作用，可降低ccl所导致的肝毒性损伤，降低肝纤维化程度以及生化指标的升高，进一步研究表明其护肝作用与其能够清除肝组织中的自由基有关。积雪草酸的抗肿瘤活性自发现起就成为了研究热点，研究发现积雪草酸所具有的抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等作用与积雪草酸能够通过线粒体介导通路诱导细胞死亡有关，并且进一步的构效关系研究表明c-28位羧基成酯的积雪草酸糖基化衍生物抗癌活性会进一步提高。对积雪草酸的降糖作用进行的深入研究发现，积雪草酸能通过对抗肾上腺素引起的肝糖原降解来遏制血糖的升高；小鼠的口服积雪草酸的实验探究结果表明，口服一定浓度的积雪草酸可显著改善实验中小鼠的认知障碍，积雪草酸能恢复脑部海马和皮层脂质过氧化物、谷胱甘肽以及sod的水平，还可以减少神经元损伤。积雪草苷在积雪草酸的分子结构基础上，具有c-28位葡萄糖-葡萄糖-鼠李糖的糖链，这种糖基化的侧链修饰可以改变三萜类化合物的物理化学性质和生物活性，使糖基化后的产物积雪草苷在保留积雪草酸主要生物活性的同时相较于积雪草酸更易溶于水，提高了积雪草酸的应用价值。

2、积雪草苷作为植物的次生代谢产物，在天然植物中的含量通常很低，意味着要从大量的植物中提取这些化合物，需要更多的时间和资源从而导致生产成本较高，因此需要开发积雪草苷的高效生产方法。为了提高积雪草苷的产量，许多生物领域的技术和方法被用于提高这种活性化合物的生产水平的研究中，例如有许多关于积雪草细胞悬浮液、愈伤组织、体外植物或毛根培养物产生积雪草苷的报道。但是相较于微生物合成，体外植物细胞培养存在生长周期较长、成本较高、分离困难等问题。因此，通过基因工程实现积雪草苷合成关键酶基因的异源表达和理性改造，进而通过提高积雪草酸的糖基化效率来提高积雪草苷产量是更好的解决方案。

技术实现思路

1、本发明提供了积雪草(centella asiatica)来源的udp-葡萄糖基转移酶caugt73ad1或其突变体在催化积雪草酸生成积雪草单葡萄糖苷中的应用。

2、在一种实施方式中，所述udp-葡萄糖基转移酶caugt73ad1具有如genbank登录号：ald84259.1所示的氨基酸序列。

3、本发明还提供了所述udp-葡萄糖基转移酶caugt73ad1的突变体，是在亲本的基础上，具有如下一个或多个突变：n4d、h70e、n205d、k242e、n481e。

4、在一种实施方式中，所述突变体是在亲本的基础上，将第4位天冬酰胺突变为天冬氨酸，获得的突变体命名为n4d。

5、在一种实施方式中，所述突变体是在亲本的基础上，将第70位组氨酸突变为谷氨酸。

6、在一种实施方式中，所述突变体是在亲本的基础上，将第205位天冬酰胺突变为天冬氨酸。

7、在一种实施方式中，所述突变体是在亲本的基础上，将第242位赖氨酸突变为谷氨酸。

8、在一种实施方式中，所述突变体是在亲本的基础上，将第481位天冬酰胺突变为谷氨酸。

9、在一种实施方式中，所述亲本具有如genbank登录号：ald84259.1所示的氨基酸序列。

10、本发明还提供了生物材料，包括(a)～(d)任一：

11、(a)编码所述udp-葡萄糖基转移酶caugt73ad1或其突变体的基因；

12、(b)携带(a)所述基因的表达载体；

13、(c)含有(a)所述基因，或(b)所述表达载体的重组微生物细胞；

14、(d)含有(c)所述重组微生物细胞的细胞催化剂。

15、在一种实施方式中，以pet系列质粒、puc系列质粒或pgex系列质粒为表达载体。

16、在一种实施方式中，以petduet-1为载体表达所述udp-葡萄糖基转移酶caugt73ad1或其突变体。

17、在一种实施方式中，所述udp-葡萄糖基转移酶caugt73ad1上游还具有诱导型启动子。

18、在一种实施方式中，所述诱导型启动子为pr启动子或trc启动子；所述pr启动子的核苷酸序列如seq id no.10所示；所述trc启动子的核苷酸序列如seq id no.11所示。

19、在一种实施方式中，所述udp-葡萄糖基转移酶caugt73ad1的n端还具有促溶标签sumo或xxa；促溶标签sumo的编码序列如seq id no.18所示；促溶标签xxa的编码序列如seqid no.20所示。

20、在一种实施方式中，所述重组质粒上含有pr启动子；所述pr启动子位于所述突变体的编码基因的上游，调控所述突变体的表达。

21、在一种实施方式中，所述突变体的基因的5’端还连接有促溶标签的编码序列；所述促溶标签包括但不限于sumo或xxa。

22、在一种实施方式中，编码促溶标签sumo的核苷酸序列如seq id no.18所示；编码促溶标签xxa的核苷酸序列如seq id no.20所示。

23、在一种实施方式中，所述重组质粒上还含有基因caugt73c7，其核苷酸序列如seqid no.22所示。

24、在一种实施方式中，所述微生物细胞是细菌细胞，包括但不限于e.coli bl21、e.coli jm109、e.coli dh5α或e.coli top10。

25、本发明还提供了表达所述udp-葡萄糖基转移酶突变体的重组大肠杆菌。

26、在一种实施方式中，所述大肠杆菌是e.coli bl21(de3)δpgiδzwfδugdδotsaδgcdδusha，是在大肠杆菌bl21(de3)的基础上，敲除了基因pgi、zwf、ugd、otsa、gcd和usha。

27、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌用诱导型启动子调控所述udp-葡萄糖基转移酶突变体的表达；所述udp-葡萄糖基转移酶突变体的n端具有促溶标签sumo或xxa。

28、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还表达了无辅因子依赖的udp鼠李糖合成酶、c-28位udp-鼠李糖基转移酶和c-28位udp-葡萄糖基转移酶。

29、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌中含有双质粒系统；所述双质粒系统包括(a)和(b)：

30、(a)重组质粒prsfduet-vvrhm-nrs-carrt1；

31、(b)重组质粒petduet-caugt73ad1-caugt73c7或petduet-caugt73ad1mut-caugt73c7；其中，mut表示突变；所述突变为n4d、h70e、n205d、k242e、n481e中的一个或多个的组合。

32、在一种实施方式中，重组质粒prsfduet-vvrhm-nrs-carrt1是以prsfduet为载体，表达无辅因子依赖的udp鼠李糖合成酶和c-28位udp-鼠李糖基转移酶。

33、在一种实施方式中，编码无辅因子依赖的udp鼠李糖合成酶的基因vvrhm-nrs具有如seq id no.24所示的核苷酸序列；编码c-28位udp-鼠李糖基转移酶的基因carrt1具有如seq id no.23所示的核苷酸序列。

34、在一种实施方式中，所述重组质粒petduet-caugt73ad1-caugt73c7是以petduet为载体，表达c-28位udp-葡萄糖基转移酶和所述udp-葡萄糖基转移酶；所述重组质粒petduet-caugt73ad1mut-caugt73c7以petduet为载体，表达c-28位udp-葡萄糖基转移酶caugt73c7和所述udp-葡萄糖基转移酶突变体。

35、在一种实施方式中，编码所述糖基转移酶的基因caugt73c7具有seq id no.22所示的核苷酸序列。

36、本发明还提供了含有所述重组微生物的细胞催化剂。

37、本发明还提供了制备所述细胞催化剂的方法，所述方法是使用本领域已知的方法在适合于微生物生长的营养介质中培养重组微生物细胞；所述培养包括但不限于在摇瓶中培养，在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵；所述发酵包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵。

38、在一种实施方式中，所述方法还包括使用本领域已知的方法回收重组微生物细胞，包括但不限于离心、过滤、沉淀。

39、本发明还提供了一种全细胞催化生产积雪草苷的方法，是将所述重组微生物或所述细胞催化剂在催化体系中与积雪草酸接触，生产积雪草苷。

40、在一种实施方式中，所述催化体系含有尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)和葡萄糖。

41、在一种实施方式中，所述方法是在30～45℃，或35～40℃，或36～38℃进行反应。

42、本发明还提供了用于生产积雪草酸衍生物的复合酶，所述复合酶含有udp-葡萄糖基转移酶或其突变体。

43、在一种实施方式中，所述复合酶含有udp-葡萄糖基转移酶或其突变体和选自如下的一种或多种酶：无辅因子依赖的udp鼠李糖合成酶、c-28位udp-鼠李糖基转移酶、c-28位udp-葡萄糖基转移酶。

44、在一种实施方式中，所述复合酶含有udp-葡萄糖基转移酶或其突变体，以及c-28位葡萄糖基转移酶，可将积雪草酸转化生产积雪草酸二葡萄糖苷。

45、在一种实施方式中，所述复合酶包括无辅因子依赖的udp鼠李糖合成酶、c-28位udp-鼠李糖基转移酶、c-28位udp-葡萄糖基转移酶及所述udp-葡萄糖基转移酶或其突变体，可将积雪草酸转化生产积雪草苷。

46、在一种实施方式中，所述无辅因子依赖的udp鼠李糖合成酶含有seq id no.27或与seq id no.27具有至少98％同一性的氨基酸序列。

47、在一种实施方式中，所述c-28位udp-鼠李糖基转移酶含有seq id no.26或与seqidno.26具有至少98％同一性的氨基酸序列。

48、在一种实施方式中，所述c-28位udp-葡萄糖基转移酶含有seq id no.25或与seqid no.25具有至少98％同一性的氨基酸序列。

49、在一种实施方式中，所述udp-葡萄糖基转移酶含有如genbank登录号：ald84259.1所示的氨基酸序列或与genbank登录号：ald84259.1所示序列具有至少98％同一性的氨基酸序列。

50、在一种实施方式中，所述突变体是在如genbank登录号：ald84259.1所示的氨基酸序列的基础上，具有如下一个或多个突变：n4d、h70e、n205d、k242e、n481e。

51、本发明还提供了一种催化生产积雪草酸衍生物的方法，所述方法是将生物催化剂在催化体系中与积雪草酸接触；所述积雪草酸衍生物包括但不限于积雪草酸单葡萄糖苷、积雪草酸二葡萄糖苷或积雪草苷；所述生物催化剂为(a)、(b)或(c)：

52、(a)所述udp-葡萄糖基转移酶突变体；

53、(b)所述重组大肠杆菌或所述细胞催化剂；

54、(c)所述复合酶。

55、在一种实施方式中，所述催化体系含有尿苷二磷酸葡萄糖和/或葡萄糖。

56、在一种实施方式中，所述反应是在30～45℃，或35～40℃，或36～38℃反应至少16h，或至少24h，或至少48h。

57、本发明还提供所述突变体、所述生物材料、所述复合酶或所述重组微生物在制备积雪草酸衍生物或含积雪草酸衍生物的产品中的应用。

58、在一种实施方式中，所述积雪草酸衍生物包括但不限于积雪草酸单葡萄糖苷、积雪草酸二葡萄糖苷、积雪草苷。

59、在一种实施方式中，所述产品包括但不限于食品、保健品、日化用品或药物。

60、在一种实施方式中，所述产品为食品补充剂。

61、在一种实施方式中，所述产品为抗炎、抗过敏和/或抗肿瘤的药物。

62、在一种实施方式中，所述日化用品包括但不限于化妆品、洗发水、沐浴露等。

63、有益效果：

64、(1)本发明以一株敲除了糖酵解途径和udp-葡萄糖分支代谢途径的大肠杆菌escherichia coli bl21(de3)eg11为宿主，以质粒petduet-1作为载体，对比了9个不同植物来源的udp-葡萄糖基转移酶对催化积雪草酸c28位糖基化生成积雪草酸单葡萄糖苷的效果，筛选获得了催化效率最优的来源于积雪草的caugt73ad1。

65、(2)本发明通过更换表达启动子t7为pr启动子，并在udp-葡萄糖基转移酶n端融合表达促溶标签xxa提高了caugt73ad1的可溶性表达水平和催化积雪草酸的转化效率。

66、(3)本发明还通过基于理性设计对caugt73ad1表面电荷优化，应用rosettasupercharge预测到19个突变体，突变后有5个突变体(n4d、h70e、n205d、k242e、n481e)对积雪草酸糖基化修饰的效率提高了5％以上，进行迭代突变后双突变体h70e/n205d和h70e/n481e葡萄糖糖基化修饰积雪草酸生成积雪草单葡萄糖苷的转化率进一步提高至65.4％和67.6％。

67、(4)本发明将前述构建的用pr启动子、n端融合表达促溶标签xxa的双突变体caugt73ad1h70e/n481e用于酶级联催化积雪草酸合成积雪草苷的系统中，相比利用t7启动子表达的野生型caugt73ad1(2.7mg/l)，产量增加了3.37倍，积雪草苷产量达到11.8mg/l。