一种免疫层析检测试纸及其应用的制作方法

本发明涉及医学检验，尤其涉及一种免疫层析检测试纸及其应用，具体涉及一种免疫层析检测试纸和一种提高免疫层析检测试纸条灵敏度的方法。

背景技术：

1、免疫层析法的原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

2、免疫层析是在免疫渗滤的基础上建立的一种简单快速的免疫学检测技术，其最大优点就是快速方便，但存在着灵敏度不足，变异系数大，特异性有限等弊端。与生化和化学发光等发法学相比，一个最大的区别在于：生化法和化学发光法中，样本与抗体有稳定的孵育时间，并能充分混匀，反应十分充分。而免疫层析法一般加样之后10秒至30秒样本与抗体混合即到达nc膜的检测线处，留给样本与结合垫上抗体反应的时间非常短暂。

3、虽然随着抗体致敏微球保存技术的进步，出现了将微球与样本预混，先反应数分钟，然后再进行层析，提高灵敏度的同时降低了变异系数，但这种方式一般需要将微球冻干，或保存在2～8℃环境中，增加了成本；另外也存在着检测操作复杂化，反应时间加长等弊端。

4、现有技术中存在较短的反应时间的缺陷，因此，如何有效快速促进样本与抗体充分反应已成为目前亟待解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明目的是提供一种免疫层析检测试纸及其应用，免疫层析检测试纸中设置有隔膜结构，该隔膜结构具有遇水溶解的特点，短暂阻挡层析进程，进而达到增加样本与结合垫上生物活性物质反应的时间，让样本与结合垫上的生物活性物质更充分的反应，进而提升检测灵敏度。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种免疫层析检测试纸，所述免疫层析检测试纸包括pvc胶板和pvc胶板上含有搭接设置的垫片、nc膜和吸水纸；

4、所述免疫层析检测试纸中设置有隔膜结构，所述隔膜的有效溶断宽度为1mm-5mm，例如可以是1mm、2mm、3mm、4mm或5mm等。

5、所述隔膜结构位于检测线与滴加致敏物区域之间，或位于检测线与含致敏物的致敏线之间。

6、本发明创造性地在免疫层析检测试纸中设置有隔膜结构，所述隔膜具有遇水溶解的特点，短暂阻挡层析进程，进而达到增加样本与结合垫上生物活性物质反应的时间，让样本与结合垫上的生物活性物质更充分的反应，进而提升检测灵敏度。

7、本发明将隔膜放置在于聚酯纤维支撑垫与结合垫之间或位于结合垫前端中任意位置，能够显著提升检测试纸的分析灵敏度，测试具有重复性。隔膜的有效溶断宽度为1mm-5mm，能够有效降低变异系数，使检测具有较高的灵敏度且较好的重复性。

8、优选地，所述垫片包含样品垫和/或结合垫。

9、优选地，所述样品垫和结合垫之间还包括滤血垫；

10、优选地，所述隔膜结构位于检测线与含致敏物的致敏线之间时，所述含致敏物的致敏线位于样品垫或结合垫上，

11、所述含致敏物的致敏线上含有与抗原特异性结合的抗体；

12、优选地，所述抗体通过如下任意一种方式致敏：

13、(1)偶连彩色微球；(2)偶连荧光微球；(3)偶联时间分辨荧光微球；(4)结合胶体金颗粒；

14、优选地，所述微球的存在形式包括在稀释液中或在结合垫上或在样品垫上任意一种；

15、优选地，所述隔膜结构位于检测线与滴加致敏物区域之间时，所述滴加致敏物区域位于样品垫上。

16、优选地，所述隔膜具有遇水溶解的性质。

17、本发明中，在免疫层析检测试纸所设置的隔膜，能够有效阻挡反应液的流动，能够促进样本与抗体的充分反应，反应后反应液需顺利通过隔膜后的结构，为此本发明选择具有遇水即溶性质的隔膜，该隔膜遇到反应液进行溶解，无需人工或增加额外的操作促进反应液的流通，大大降低了成本以及反应时间。

18、优选地，所述隔膜的厚度为20μm-1000μm，例如可以是20μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm等。

19、本发明中，隔膜的厚度极大程度影响反应的时间以及灵敏度，隔膜厚度过高，会导致反应液不易溶解隔膜，增大反应时间；隔膜厚度过低，或导致隔膜易被反应液溶解，导致样本与抗体混合不充分，降低了检测的灵敏度，在隔膜厚度为20μm-1000μm的范围下，能够降低反应时间且显著提升检测的灵敏度。

20、优选地，所述隔膜包括水凝膜、水溶膜、淀粉膜或胶囊壳/膜中的任意一种。

21、优选地，所述隔膜的制备原料包括pva、明胶、卡拉胶、骨胶、hpmc、纤维素、普鲁兰中的任意一种或至少两种的组合。

22、优选地，所述隔膜的存在形式包括：以隔膜层形式存在，或以液态凝固后形成于结合垫或nc膜上的形式存在。

23、本发明中，隔膜可以以两种形态存在，一种是隔膜层的形式，将隔膜层直接黏附在检测试纸上；另一种是将原料以液态凝固，直接在样品垫、结合垫或nc膜上进行划线，当烘干后在试纸上形成隔膜层，上述两种形式均可以有效提升反应检测的灵敏度。

24、优选地，所述液态凝固的制备方法包括将原料溶于水中，制成原料液，将原料液在所述免疫层析检测试纸上进行划线和过烘，烘干获得含有隔膜的检测试纸。

25、优选地，所述原料液中按重量份数计包括：5份-15份原料和85份-95份水，所述5-15份例如可以是5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份或15份等，所述85-95份，例如可以是85份、86份、87份、88份、89份、90份、91份、92份、93份、94份或95份等。

26、本发明中，原料液所占比例范围对检测灵敏度具有一定影响，浓度过高，反应液溶解隔膜时间过长；浓度过低，样本与抗体反应不充分，减低反应灵敏度。

27、优选地，所述划线和过烘过程中烘干的温度为35℃-40℃，时间为0.5h-2h。所述35℃-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等。所述0.5h-2h，例如可以是0.5h、1h、1.5h或2h等。

28、优选地，所述划线和过烘操作重复进行3次-5次，例如可以是3次、4次或5次.

29、优选地，对得到的含有隔膜的检测试纸进行烘干，烘干的温度为35℃-40℃，时间为10h-16h。所述35℃-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等。所述10h-16h，例如可以是10h、11h、12h、13h、14h、15h或16h等。

30、优选地，当所述隔膜结构以隔膜层形式存在时所述免疫层析检测试纸还包括卡壳。

31、优选地，所述卡壳上隔膜上方对应的位置设置有压条，通过卡壳将结合垫与隔膜紧密压实。

32、第二方面，本发明提供一种提高免疫层析检测试纸条灵敏度的方法，所述检测方法包括：

33、将反应液加入第一方面所述的免疫层析检测试纸中，将免疫层析检测试纸插入检测机器进行检测并记录试纸推入仪器的时间；通过仪器识别视窗口灰度变化或光信号变化，判断反应液进入视窗时间。

34、优选地，所述视窗内对应层析试纸条nc膜。

35、优选地，所述灰度变化包括由于对光的吸收导致的光信号的变化以及光折射/反射导致接收到的光信号减弱导致的变化。

36、优选地，所述光信号包括接收到的荧光信号或经激发之后接收到的光信号。

37、优选地，所述试纸推入仪器的时间与所述反应液进入视窗时间的差值为样本与结合垫上抗体与生物活性物的混合反应时间。

38、本发明中，检测方法是通过检测机器进行检测，可以有效校正隔膜溶断时间不同导致的反应时间差异，自动且快速有效的得到检测结果，降低变异系数，大大提升了检测效率，减少了检测时间。

39、优选地，所述检测方法还包括计算校准曲线。

40、优选地，所述校准曲线是由系列浓度梯度校准品、抗原或样本，在不同混合反应时间下测得。

41、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

42、1.本发明在免疫层析检测试纸所设置的隔膜，能够有效阻挡反应液的流动，能够促进样本与抗体的充分反应，反应后反应液需顺利通过隔膜后的结构，为此本发明选择具有遇水即溶性质的隔膜，该隔膜遇到反应液进行溶解，无需人工或增加额外的操作促进反应液的流通，大大降低了成本以及反应时间。

43、2.本发明中隔膜的厚度，隔膜所含原料的占比以及隔膜所具有的遇水即溶的性质，增加了样品与抗体的反应时间，大大增加了反应的检测灵敏度，提升了检测的重复性，降低了检测试纸的变异系数。

44、3.本发明采用检测机器自动检测，降低变异系数，大大提升了检测的效率，缩短了检测时间，可快速获得准确有效的监测数据，可用于批量检测大量样本。