一种胶质纤维酸性蛋白质控品及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物制品，具体涉及一种胶质纤维酸性蛋白质控品及其制备方法和应用。

背景技术：

1、中枢神经系统损伤可分为创伤性脑损伤(tbi)、脑血管损伤以及创伤性脊髓损伤，tbi是全世界常见的神经性残疾原因，主要发生在年轻人中。对病人护理的评估标准目前往往取决于颅部ct等放射学手段，这对长期暴露在电离辐射条件下的患者有消极的影响，研究人员通过对颅内或人体血液中胶质纤维酸性蛋白(glail fibrillary acidicprotein，gfap)的检测，发现血清gfap的含量达到一定值时，能够预测头部ct上颅内损伤程度。

2、胶质纤维酸性蛋白是一种ⅲ型中间丝状蛋白，以单体形式存在，主要存在于成熟的星形胶质细胞内，是星形胶质细胞的重要组成部分，也是主要的细胞骨架，除了在神经系统星形胶质细胞内高量表达外，gfap在软骨细胞、成纤维细胞、肌上皮细胞、淋巴细胞、肝星形细胞也有表达，中间纤维蛋白在大脑的不同发育时期，其表达形式也存在差异，gfap的表达受多种因素的影响，例如脑损伤和神经性肿瘤等疾病。脑损伤后中枢神经系统中星形胶质细胞常出现增生，伴随着gfap的表达增加，这是退行性病变及中枢神经损伤引发神经组织变化的主要表现。s100β和gfap是两种主要的神经胶质细胞标记蛋白，与s100β蛋白相比，gfap在脑损伤患者的血清中出现峰值的时间更早、特异性更强、敏感性更高，因此，它可以用作脑损伤的标志物用于医学诊断。

3、然而，当前市面质控品种类较少，多数厂家生产的试剂盒中不含有质控品，而临床实验室自己配制质控品又受到诸多因素的影响，所以在临床中质量控制现状不容乐观，亟待改善。并且现有少数的胶质纤维酸性蛋白质控品还存在稳定性差、准确度低等问题，无法充分满足临床使用需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种胶质纤维酸性蛋白质控品及其制备方法和应用。用于解决现有的胶质纤维酸性蛋白质控品还存在稳定性差、准确度低等问题。

2、在第一方面，本发明提供了一种胶质纤维酸性蛋白质控品，包括胶质纤维酸性蛋白(gfap)抗原和质控品稀释液；其中，质控品稀释液包括质量浓度为1.0～8.0％(例如可以为1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％或该范围内的其他数值)的复合蛋白保护剂、质量浓度为0.5～6.0％(例如可以为0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％或该范围内的其他数值)的填充剂、质量浓度为0.1～1％(例如可以为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％或该范围内的其他数值)的表面活性剂、质量浓度为0.05％～0.1％(例如可以为0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％或该范围内的其他数值)的防腐剂和质量浓度为1.0～5.0％(例如可以为1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％或该范围内的其他数值)的叔丁醇。

3、保护剂是一类在冻干生物制品中起到低温保护作用和填充作用的一类或几类物质，一种物质具体发挥低温保护作用还是填充作用，有时无法严格区分。生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过程，会产生低温、冷冻和脱水等多种效应，冷冻干燥过程完成后，在长期保存过程中保证冻干品的形态和活性组分的稳定性也是难点之一。

4、因此，本发明中，发明人研究发现，在胶质纤维酸性蛋白质控品中添加特定含量的复合蛋白保护剂、填充剂、表面活性剂、防腐剂和叔丁醇，上述组分之间协同作用，防止活性组分发生变性和保证冻干品的形态，并且能显著提高胶质纤维酸性蛋白质控品的稳定性和准确度。

5、在一些实施方案中，复合蛋白保护剂包括酪蛋白和/或明胶；酪蛋白与明胶的质量比为3:(1～1.2)，例如可以为3:1、3:1.05、3:1.1、3:1.15、3:1.2或该范围内的其他比值。

6、本发明中，发明人进一步研究发现，酪蛋白分子量一般在2000～2500kda，具有较好的热稳定性和水合性；明胶分子量通常在500～1000kda，是由胶原蛋白多级水解得到的一种肽分子聚合物质，因优异的吸水膨胀软化作用，在食品行业可用作增稠剂。酪蛋白和明胶都属于大分子蛋白质，在冻结过程中会优先析出，对抗原起到一定保护作用，还能提高玻璃化转变温度和溶液粘度，同时，较大的分子量使其在脱水干燥过程中又是很好的填充剂，为冻干品提供很强的支撑作用。

7、在一些实施方案中，质控品稀释液的ph值为7-9，例如可以为7、7.5、8、8.5、9或该范围内的其他数值。

8、本发明中，发明人研究发现，将质控品稀释液的ph值控制在7-9的范围内，能进一步增加胶质纤维酸性蛋白质控品的稳定性。

9、需要说明的是，可以使用现有技术中常规的酸(例如硫酸、盐酸和硝酸)或者常规的碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙)来调节质控品稀释液的ph值为7-9。

10、在一些实施方案中，填充剂为甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、甘氨酸、明胶中的一种或多种。

11、在一些优选的实施方案中，填充剂包括海藻糖和甘氨酸。

12、氨基酸是蛋白质的基本构成单位，其包括氨基(-nh2)和羧基(-cooh)、表现出酸、碱两性，能够在冻干品的冷冻干燥过程和低温保存过程中抑制溶液ph的变化，达到保护活性组分的目的。

13、因此，本发明中，发明人进一步研究发现，在质控品中加入甘氨酸，不仅能维持质控品稀释液的中性偏碱性缓冲环境作用，以保证质控品的稳定性，而且它还是最佳的氨基酸类填充剂，可以保持冻干品的形态。

14、在一些实施方案中，表面活性剂为吐温20、表活s9、甜菜碱、曲拉通x100、chaps中的一种或多种。

15、在一些优选的实施方案中，表面活性剂为表活s9。

16、表面活性剂是一类含有亲水基团和疏水基团，且具有湿润、乳化、分散及渗透等特性的两亲分子。在质控品冻干过程中起到降低冰水界面张力所引起的冻结和脱水变性作用，又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂的作用。

17、因此，本发明中，发明人进一步研究发现，表活s9具有良好的界面活性，又兼备阴、阳离子表面活性剂的优点，同时还具有良好的乳化能力和分散能力，可保证质控品在冻干过程中活性组分不受影响，及后续保存时的稳定性。

18、在一些实施方案中，防腐剂为proclin300、bnd和硫酸庆大霉素中的一种或多种。

19、本发明中，加入防腐剂后，能进一步提高胶质纤维酸性蛋白质控品的稳定性，延长质控品的保存时间。

20、在一些实施方案中，胶质纤维酸性蛋白质控品包括高浓度水平质控品和低浓度水平质控品；其中，在高浓度水平质控品中，胶质纤维酸性蛋白抗原的浓度为640～960pg/ml，例如可以为640pg/ml、700pg/ml、750pg/ml、800pg/ml、850pg/ml、900pg/ml、960pg/ml或该范围内的其他数值；在低浓度水平质控品中，胶质纤维酸性蛋白抗原的浓度为40～60pg/ml，例如可以为40pg/ml、45pg/ml、50pg/ml、55pg/ml、60pg/ml或该范围内的其他数值。

21、在第二方面，本发明提供了一种胶质纤维酸性蛋白质控品的制备方法，包括以下步骤：将复合蛋白保护剂、填充剂、表面活性剂、防腐剂和叔丁醇混合均匀后过滤，得到质控品稀释液；将胶质纤维酸性蛋白抗原加入到质控品稀释液中，混合均匀得到液态胶质纤维酸性蛋白质控品。

22、本发明中，胶质纤维酸性蛋白质控品的制备方法和工艺简单，并且原料易于获得，生产成本低，适合大规模生产应用。

23、在一些实施方案中，在得到液态胶质纤维酸性蛋白质控品后，还包括对液态胶质纤维酸性蛋白质控品进行分装、冷冻干燥和保存的步骤；其中，保存的温度为2-8℃。

24、冻干过程一般耗时长、耗能多，因此需要对冻干循环进行优化以降低生产成本。本发明中，向质控品中添加的叔丁醇是一种小分子醇，与水互溶，既可以单独作为冻干溶剂，又可以与水组成复合溶剂，在冻干溶液中加入适量叔丁醇后，冻结时会形成针状结晶，冰晶升华后，留下管状通道，使水蒸气流动阻力大大减少，升华速率显著提高且使冻干品易于形成较好的形态，对缩短整个冻干过程有较大作用。

25、在第三方面，本发明提供了上述任一项胶质纤维酸性蛋白质控品在制备胶质纤维酸性蛋白检测试剂中的应用。

26、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

27、1)本发明提供的胶质纤维酸性蛋白质控品的制备方法和工艺简单，且瓶间变异小、均匀性好、适合大规模生产；

28、2)本发明提供的胶质纤维酸性蛋白质控品使用缓冲剂基质，并添加了适量复合蛋白保护剂、填充剂、防腐剂、表面活性剂和叔丁醇，原料易于获得且能有效保证关键组分的活性，保证了胶质纤维酸性蛋白质控品具有良好的准确度；

29、3)本发明提供的胶质纤维酸性蛋白质控品的临床一致性和稳定性好，在37℃条件下放置7天对稳定性无影响，避免了运输或使用过程中环境温度可能产生的干扰，复溶后在2～8℃可保存60天，稳定性好。