与华南鲤快速生长性状相关的SNP标记及应用的制作方法

本发明属于动物分子生物学dna标记技术与应用，具体涉及与华南鲤快速生长性状相关的snp标记及应用。

背景技术：

1、华南鲤(cyprinus carpio rubrofuscus)属鲤形目(cypriniformes)，鲤科(cyprinidae)、鲤属(cyprinus)。华南鲤分布于南岭以南水系，如珠江、元江和海南岛等华南地区，是重要的养殖品种，其中稻田养殖的华南鲤已成为两广地区的一张重要名片，实现资源利用最大化的同时也大大增加了养殖户的收益。作为世界上重要的经济水产动物之一，提高鲤鱼的产量和品质一直是育种工作的重要目标。然而，在养殖过程中由于长期近亲繁殖，导致群体遗传多样性显著降低，种质退化严重，部分个体出现生长缓慢的问题。因此，开发可靠的育种技术，获得生长速度快的华南鲤个体，淘汰生长缓慢的华南鲤个体不但可以节约饲料成本，也能缩短养殖周期进而大幅度降低华南鲤养殖成本。考虑到传统的亲本或群体选育效率较低且选育的过程费时费力，分子标记逐渐成为辅助选育的强有力的工具。随着测序技术的飞速发展以及测序成本的下降，全基因组测序技术已被普遍应用于水产动物的重要性状的分子标记的开发。与传统的微卫星、简化基因组技术相比，全基因重测序可以覆盖整个基因组位点，极大提高了数据分析精度和准确性。现有技术中有研究者利用全基因组重测序技术分析了珠蚌中与生长或性别性状相关的候选基因，并构建了高密度遗传图谱。以及基于基因组重测序数据鉴定到与太平洋牡蛎生长及贝壳形状相关的snp位点(g26854_18684937)。综上所述，基于全基因组测序的分子标记开发技术已成为选育工作的重要研究手段。

2、目前，已有研究报道了与鲤鱼生长相关的分子标记，例如通过简化基因组筛选出与黄河鲤生长相关的关键基因adrb2a；利用250k芯片技术鉴定到与黄河鲤生长的候选基因kiss2、igf1、smtlb和npffr1。然而，目前在华南鲤育种中，与生长性状相关的分子标记仍有待开发。因此，开发与华南鲤快速生长相关snp标记，对加速华南鲤分子选育具有重要的意义。

3、g蛋白偶联受体75基因(g-protein-coupled receptor 75，gpr75)编码含有540个氨基酸的膜蛋白受体，具有典型的g蛋白偶联受体的结构特征，即7个跨膜结构域，n端位于胞外，c端位于胞内。目前，gpr75在脑神经系统、心血管以及体重相关的代谢功能已在人类和小鼠中得到初步阐明。现有学者基于64.5万个体的外显子组测序发现，携带gpr75蛋白截断突变的个体比正常个体的平均bmi(身体质量指数，body mass index)低1.8kg/m2，体重下降5.3kg。为了进一步验证gpr75基因对体重的影响，研究人员用高脂食物投喂gpr75杂合或者纯合突变的小鼠以及正常小鼠，发现正常小鼠在14周内体重增加了一倍，杂合突变的小鼠(gpr75+/-)体重比正常小鼠低25％，而纯合突变的小鼠(gpr75-/-)体重比正常小鼠低44％。但目前没有相关研究表明gpr75基因是否也能调控华南鲤的生长。

4、基于上述内容，提出本技术。

技术实现思路

1、本发明通过利用分子遗传学及分子生物学的方法获得华南鲤生长相关的snp分子标记，所述snp分子标记可用于快长华南鲤新品种(系)选育。

2、本发明第一方面的目的，在于提供与华南鲤生长性状相关的snp分子标记。

3、本发明第二方面的目的，在于提供用于扩增本发明第一方面的snp分子标记的引物组。

4、本发明第三方面的目的，在于提供一种检测试剂、基因芯片或试剂盒。

5、本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的snp分子标记、本发明第二方面的引物组和/或本发明第三方面的检测试剂、基因芯片或试剂盒的应用。

6、本发明第五方面的目的，在于提供一种筛选华南鲤生长快慢的方法。

7、本发明第六方面的目的，在于提供本发明第五方面的方法在选育生长优异华南鲤品种中的应用。

8、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

9、本发明的第一个方面，提供与华南鲤生长性状相关的snp分子标记，所述snp分子标记包括snp17_4687、snp17_4688、snp17_4689、snp17_4691、snp17_4692、snp17_4694、snp17_4695、snp17_4758、snp17_4761或snp17_4762中至少一种；

10、其中，

11、所述snp17_4687的snp位点位于gpr75基因序列seq id no:1所示序列自5’端起第51位，其多态性为c/t；

12、所述snp17_4688的snp位点位于gpr75基因序列seq id no:1所示序列自5’端起第58位，其多态性为c/t；

13、所述snp17_4689的snp位点位于gpr75基因序列seq id no:1所示序列自5’端起第68位，其多态性为t/c；

14、所述snp17_4691的snp位点位于gpr75基因序列seq id no:1所示序列自5’端起第94位，其多态性为t/a；

15、所述snp17_4692的snp位点位于gpr75基因序列seq id no:1所示序列自5’端起第96位，其多态性为a/t；

16、所述ssnp17_4694的snp位点位于gpr75基因序列seq id no:1所示序列自5’端起第124位，其多态性为c/a；

17、所述snp17_4695的snp位点位于gpr75基因序列seq id no:1所示序列自5’端起第137位，其多态性为t/c；

18、所述snp17_4758的snp位点位于gpr75基因序列seq id no:1所示序列自5’端起第1247位，其多态性为t/c；

19、所述、snp17_4761的snp位点位于gpr75基因序列seq id no:1所示序列自5’端起第1378位，其多态性为c/g；

20、所述snp17_4762的snp位点位于gpr75基因序列seq id no:1所示序列自5’端起第1379位，其多态性为a/t。

21、在本发明一些实施方式中，当snp17_4687、snp17_4688、snp17_4689、snp17_4691、snp17_4692、snp17_4694、snp17_4695、snp17_4758、snp17_4761或snp17_4762的基因型依次为cc、cc、tt、tt、aa、cc、tt、tt、cc、aa，则为快速生长的华南鲤，当snp17_4687、snp17_4688、snp17_4689、snp17_4691、snp17_4692、snp17_4694、snp17_4695、snp17_4758、snp17_4761或snp17_4762的基因型依次为ct、ct、ct、at、at、ac、ct、ct、cg、at，则为缓慢生长的华南鲤。

22、本发明基于全基因组重测序获得具有育种价值的10个snp分子标记，可应用在华南鲤的分子标记辅助育种上，加快选育具有优良生长性状的华南鲤品种、增加生产效益，为华南鲤的选育工作提供参考依据。

23、本发明的第二个方面，提供用于扩增本发明第一方面的snp分子标记的引物组。

24、在本发明一些实施方式中，所述引物组包括引物对1和引物对2，所述引物对1的核苷酸序列如下所示：

25、f：5'-tgctgtccattcacggct-3'；

26、r：5'-tggtagaccctctggattgc-3'；

27、所述引物对2的核苷酸序列如下所示：

28、f：5'-tcatttggtgatgctatacttc-3'；

29、r：5'-tgctaacggcaagtctca-3'。

30、在本发明一些实施方式中，所述引物对1用于扩增snp17_4687、snp17_4688、snp17_4689、snp17_4691、snp17_4692、snp17_4694和snp17_4695，所述引物对2用于扩增snp17_4758、snp17_4761和snp17_4762。

31、本发明的第三个方面，提供一种包含本发明第二方面的引物组的检测试剂、基因芯片或试剂盒。

32、在本发明一些实施方式中，所述检测试剂、基因芯片或试剂盒还包括pcr中使用的缓冲液。

33、在本发明一些实施方式中，所述pcr中使用的缓冲液为pcr扩增所需要的任何试剂，比如dntp、taq酶、mgcl2等。

34、本发明第四个方面，提供本发明第一方面的snp分子标记、本发明第二方面的引物组和/或本发明第三方面的检测试剂、基因芯片或试剂盒在(1)～(6)中任一项中的应用：

35、(1)华南鲤辅助选育或育种；

36、(2)制备华南鲤辅助选育或育种的产品；

37、(3)判断或鉴别华南鲤生长快慢；

38、(4)制备判断或鉴别华南鲤生长快慢的产品；

39、(5)华南鲤种质资源管理和开发利用；

40、(6)华南鲤品种保护、评价。

41、在本发明一些实施方式中，所述选育为筛选得到快速生长的华南鲤品种(系)。

42、在本发明一些实施方式中，所述育种或辅助育种包括辅助的主效基因选择、分子辅助育种、全基因组选择育种、华南鲤品种鉴定、遗传图谱构建、基因定位、物种进化分析和种质资源鉴定中的至少一种

43、本发明的第五个方面，提供一种筛选华南鲤生长快慢的方法，通过检测待测华南鲤的基因组中本发明第一方面的snp分子标记的基因型，根据基因型确定所述待华南鲤的生长快慢。

44、在本发明一些实施方式中，以待测华南鲤dna为模板，使用本发明第二方面的引物组或本发明第三方面的检测试剂、基因芯片或试剂盒进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对pcr扩增产物进行测序分析，确定待测华南鲤的基因组中本发明第一方面的snp分子标记的基因。

45、在本发明一些实施方式中，当snp17_4687、snp17_4688、snp17_4689、snp17_4691、snp17_4692、snp17_4694、snp17_4695、snp17_4758、snp17_4761或snp17_4762的基因型依次为cc、cc、tt、tt、aa、cc、tt、tt、cc、aa，则为快速生长的华南鲤，当snp17_4687、snp17_4688、snp17_4689、snp17_4691、snp17_4692、snp17_4694、snp17_4695、snp17_4758、snp17_4761或snp17_4762的基因型依次为ct、ct、ct、at、at、ac、ct、ct、cg、at，则为缓慢生长的华南鲤。

46、在本发明一些实施方式中，所述华南鲤的dna可以采用本技术领域的常规手段提取得到，包括酚氯仿法和各种dna提取试剂盒。

47、在本发明一些实施方式中，pcr扩增的反应程序为90～94℃预变性3～6min；90～94℃变性40～60s，56～60℃退火50～110s，70～72℃延伸60～70s，28～35个循环；70～72℃延伸5～10min。

48、在本发明一些实施方式中，所述测序包括使用sanger法、二代测序等进行测序。

49、本发明的第六个方面，提供本发明第五个方面的方法在选育生长优异华南鲤品种中的应用。

50、本发明的有益效果是：

51、本发明通过对同一华南鲤群体中快速生长个体和缓慢生长个体进行全基因重测序并展开全基因组关联分析，筛选出与华南鲤快速生长性状相关的snp标记及其分型信息。基于分子标记的序列设计特异性引物，可快速准确的检测与生长相关的位点，通过检测该snp标记，能够在相同养殖条件下有效地挑选快速生长的华南鲤，能够有效用于华南鲤的分子标记辅助育种，为选育提供技术支持。

52、通过检测该snp标记，能够根据实际育种需求对华南鲤亲本进行基因型鉴定，挑选合适的基因型华南鲤亲本进行繁殖，可以获得具有优良生长性状的华南鲤品种(即快速生长的华南鲤后代(鱼苗))，节约育种时间，成本低廉，准确性高，加快华南鲤育种进程。

53、本发明所获得的基因型是依据基因内部产生的碱基突变，因此不存在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证。