一种可降解联苯的需钠弧菌菌株及其制备方法和用途

本发明涉及生物工程菌领域，尤其涉及一种可降解联苯的需钠弧菌菌株及其制备方法和用途。

背景技术：

1、联苯(biphenyl)是一种由两个苯环组成的芳香化合物，是多环芳烃(pahs)中的一种，天然存在于煤焦油、原油、天然气中，通过化石燃料的燃烧进入大气以及水体、土壤。联苯对于人体以及其他动物的健康有害，长期接触可能导致呼吸系统疾病和心血管疾病，还影响免疫、代谢和生殖系统的共轭能和发育，此外还有致癌、致畸、致突变等影响。

2、现有的有毒有机污染物处理方法主要分为化学法、物理法和生物法。化学法主要通过氧化的手段处理有毒有机污染物，在修复的过程中往往导致水体、土壤的理化性质破坏，造成二次污染；物理法对于有毒有机物染物不能起到彻底的降解效果，而且在手机和转运污染物的过程中也有造成二次污染的风险。

3、利用微生物的降解作用处理有机污染物是一种廉价、彻底的处理方法，而且不产生二次污染。生物法处理有毒有机污染物的重要限制因素是微生物菌株资源。环境中天然存在的联苯降解菌株生长速度较慢此外，环境中筛选得到的联苯降解菌株可能携带抗生素抗性基因或致病基因，从而产生生物风险。利用合成生物学的方法，以生物安全的菌株被底盘细胞，构建具有联苯降解基因簇的菌株，可以突破自然进化的时间限制，从而快速地获得联苯降解菌株，用于海水、含盐工业废水中联苯的去除。

4、因此，本领域的技术人员致力于开发一种生长迅速，无生物毒性，且能在海水等盐度较高的水体环境中生存并降解联苯的菌株。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种生长迅速，无生物毒性，且能在海水等盐度较高的水体环境中生存并降解联苯的菌株及其使用方法。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种可降解联苯的需钠弧菌菌株的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

3、步骤1、配制培养基；

4、步骤2、接种并培养vmax菌；

5、步骤3、将联苯降解代谢人工基因簇转录至步骤2中培养的细菌中；

6、步骤4、将所述人工基因簇通过自然转化安装在需钠弧菌vmax菌株的2号染色体上，得到的工程菌被命名为vcod-3；

7、步骤5、接种步骤4中的vcod-3菌株于液体培养基中，诱导人工基因簇表达后，进行饥饿处理，得到vcod-3休止细胞，即为可降解联苯的需钠弧菌菌株。

8、在本发明的较佳实施方式中，所述步骤3还包括：

9、所述联苯降解代谢人工基因簇为bpha1234bckhjid，由11个基因组成，该基因簇克隆自恶臭假单胞菌b6-2的基因组，经过密码子优化后通过化学合成获取该基因簇。

10、在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤3还包括：

11、所述基因簇克隆自恶臭假单胞菌b6-2的基因组，在bpha1前和bphd后分别添加t7启动子和t7终止子用于调控其转录和表达，其余每个基因之前添加核糖体结合位点b0030，该基因簇碱基序列如seq id no.3所示。

12、在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤4具体包括：

13、在需钠弧菌vmax的1号染色体dns基因位点插入受到t7启动子调控的tfox基因，此时，该菌株能在iptg诱导后通过自然转化吸收线性dna片段并通过同源重组将dna片段整合到染色体上，再将所述人工基因簇以线性dna片段的形式，通过需钠弧菌的自然转化递送至胞内后由vmax自身同源重组系统整合至其2号染色体chr2_297位点上，得到vcod-3菌株。

14、在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤5还包括：

15、步骤5.1、制备nss模拟海水溶液；

16、步骤5.2、将vcod-3菌株接种于lb3液体培养基中，30℃200rpm培养45分钟，在容器内加入终浓度为1mm的iptg，诱导人工基因簇表达12小时；

17、步骤5.3、使用所述nss模拟海水溶液洗涤重悬诱导表达后的菌株，将剩余菌体重悬于nss模拟海水或工业废水中，饥饿处理后，得到vcod-3休止细胞。

18、在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤5.1中的nss模拟海水溶液配方如下：

19、氯化钠(nacl)7.6g/l，硫酸钠(na2so4)1.47g/l,碳酸氢钠(nahco3)0.08g/l，氯化钾(kcl)0.25g/l，溴化钾(kbr)0.04g/l，六水氯化镁(mgcl2·6h2o)1.87g/l。二水氯化钙(cacl2·2h2o)0.45g/l，六水氯化锶(srcl2·6h2o)0.01g/l，硼酸(h3bo3)0.01g/l。

20、在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤5.3具体包括：

21、将诱导表达后的菌液取出，以4625g离心20分钟，弃去上清，用nss溶液洗涤重悬，重复洗涤操作2次，将剩余菌体重悬于模拟海水或工业废水中，调节od600约为10，在30℃200rpm条件下进行饥饿处理2小时，得到vcod-3休止细胞。

22、在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤5.3中的饥饿处理具体包括：

23、4000g离心10min以去除上清液，用nss模拟海水重悬菌体，重复2次，用nss稀释定容至od600＝10.0后，在30℃摇床中以220rpm的转速培养2小时以进行饥饿处理。

24、本发明还提供如前述的一种可降解联苯的需钠弧菌菌株的制备方法制备的菌株。

25、本发明还提供如前述的菌株的用途。

26、技术效果

27、1、本发明在底盘细胞需钠弧菌中插入联苯降解代谢基因簇，通过密码子优化使得来自恶臭假单胞菌的联苯降解基因簇能够在需钠弧菌中表达，需钠弧菌具有较高的耐盐能力，所获得的人工降解菌株可以在海水以及盐度高于海水的环境中生长和降解污染物；

28、2、利用需钠弧菌作为底盘菌株开发污染物降解菌株，需钠弧菌的基因组序列已经被测序，发现其中没有毒力因子编码基因和抗生素抗性基因，不会通过水平基因转移扩散至环境中的其他菌株，省去了基因组测序和抗生素抗性测试、毒力因子鉴定测试的步骤；

29、3、目前已报道的天然联苯降解菌株多为恶臭假单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、鞘氨醇单胞菌属。而联苯降解菌株vcod-3为需钠弧菌属，生长速度显著快于其他菌株，最快时代时可控制在10分钟内。vcod-3还具备较好的耐盐能力，可以在添加了50g/l氯化钠的液体环境中维持正常生长，因此在修复受联苯污染的海水或高盐工业废水时具有优势。

30、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

技术特征：

1.一种可降解联苯的需钠弧菌菌株的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3还包括：

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3还包括：

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4具体包括：

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5还包括：

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5.1中的nss模拟海水溶液配方如下：

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5.3具体包括：

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5.3中的饥饿处理具体包括：

9.如权利要求1-8任一项所述的一种可降解联苯的需钠弧菌菌株的制备方法制备的菌株。

10.一种如权利要求8所述的菌株的用途。

技术总结本发明公开了一种可降解联苯的需钠弧菌菌株及其制备方法和用途，涉及生物工程菌领域，该菌株的制备方法包括将联苯降解代谢人工基因簇转录入VCOD‑2菌中，得到VCOD‑3菌，制备成为VCOD‑3菌株并培养，使用NSS模拟海水重悬洗涤，并饥饿处理后，得到VCOD‑3休止细胞，即为可降解联苯的需钠弧菌菌株，该菌株生长迅速，无生物毒性，且能在海水等盐度较高的水体环境中生存并降解联苯的菌株，该、可用于海水、工业水等的污染处理。技术研发人员：唐鸿志,王伟伟,崔浩天,戴俊彪,苏聪受保护的技术使用者：上海交通大学技术研发日：技术公布日：2024/11/4