靶向人DLL3的嵌合抗原受体T细胞及其应用

本发明属于生物医药，具体而言，涉及一种靶向人dll3的嵌合抗原受体t细胞及其应用。

背景技术：

1、肺癌是全球癌症死亡人数最高的疾病，其主要分为小细胞肺癌(small-cell lungcancer，sclc)和非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，nsclc)两大类，sclc和nsclc是两种完全不同的疾病，sclc是一种高级别神经内分泌癌，约占所有肺癌的15％～20％，但其恶性程度比非小细胞肺癌更高，可选的治疗方式更少。sclc主要在吸烟和既往吸烟者中发病，临床症状主要表现为咳嗽、喘息、呼吸困难、咳血等，大多数患者首次诊断时即出现癌细胞转移至对侧肺、肝、脑、骨、肾上腺等部位，预后异常差。绝大部分sclc患者接受细胞毒性药物结合放化疗治疗后早期疗效较好，但这种反应是短暂的，患者的中位生存期小于2年，而转移患者仅有约1年。因此，急需科研工作者从临床以及生物学角度对sclc的流行病学、发病机制、分子通路、细胞通路以及新的治疗方式等方面进一步研究，从而为sclc的治疗提供新的方向。

2、delta样配体3(delta-like ligand 3，dll3)是一种ⅰ型单次跨膜蛋白，属于notch配体家族成员之一。人dll3蛋白由618个氨基酸组成，包括1个dsl结构域(175～215aa)、6个egf样重复序列(216～465aa)、一个跨膜域(493～513aa)和一个胞内结构域(514～618aa)，其中胞外n端的dsl结构域序列高度保守，是与notch受体结合的必要结构。研究表明，dll3在sclc和其他神经或神经内分泌肿瘤中高表达，而在正常组织细胞中不表达或少量表达(仅在胞内表达)；尤其在sclc中，超过80％的患者癌细胞表面有dll3的阳性表达，而在正常组织及癌旁组织中不表达，这种差异性使得dll3可能成为一种良好的靶向治疗靶点。

3、纳米抗体(nanobody，nb)是存在于驼科动物和鲨鱼体内的一种天然缺失轻链和重链第一恒定区的抗体可变区(vhh)。nb被认为是目前发现的最小的具有结合完整抗原功能的抗体分子，其结构呈橄榄球状，直径约2.5nm，高约4nm，分子量(15kda)仅为传统igg抗体分子质量的1/10。与其他抗体片段相比，nb具有高稳定性、可溶性好、亲和力高、特异性强、易偶联及易改造等特性，基于上述特性，nb被广泛应用于疾病的诊断、治疗以及科学研究中。

4、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor-t cell，car-t)作为肿瘤免疫治疗的新兴技术，在抗肿瘤研究中取得了突破性进展，尤其在多种血液系统恶性肿瘤的治疗中表现出优异的疗效，改变了血液瘤的治疗模式并有效推动了其他免疫疗法的发展。car-t是通过基因工程技术将针对肿瘤抗原的结合域与共刺激分子结构域共表达于t细胞表面，t细胞表面的抗原结合域能够特异性识别肿瘤抗原并启动下游信号通路，使得t细胞活化、增殖并释放穿孔素、颗粒酶、il-2、ifn-γ和tnf-α等细胞因子杀伤肿瘤细胞，从而达到清除肿瘤细胞的目的。

5、目前，靶向dll3用于sclc治疗的在研药物治疗形式包括单抗、adc、双抗、多抗、car-t和car-nk等，但疗效都还有待提高。

6、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题为：现有靶向人dll3的嵌合抗原受体t细胞治疗效果还有待提高的问题。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种靶向人dll3的嵌合抗原受体t细胞。

3、首先，本发明提供了一种抗dll3的纳米抗体，所述纳米抗体包括：包含cdr1、cdr2和cdr3的重链可变区，所述cdr1的氨基酸序列如seq id no:1、seq id no:5或seq id no:9所示，所述cdr2的氨基酸序列如seq id no:2、seq id no:6或seq id no:10所示，所述cdr3的氨基酸序列如seq id no:3、seq id no:7或seq id no:11所示。

4、进一步的，上述抗dll3的纳米抗体，所述纳米抗体为：cdr1的氨基酸序列如seq idno:1，cdr2的氨基酸序列如seq id no:2，cdr3的氨基酸序列如seq id no:3；

5、或cdr1的氨基酸序列如seq id no:5，cdr2的氨基酸序列如seq id no:6，cdr3的氨基酸序列如seq id no:7；

6、或cdr1的氨基酸序列如seq id no:9，cdr2的氨基酸序列如seq id no:10，cdr3的氨基酸序列如seq id no:11。

7、其中，上述抗dll3的纳米抗体中，还包括骨架区，所述纳米抗体的vhh链的结构为：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。

8、进一步的，上述抗dll3的纳米抗体中，所述纳米抗体的vhh链的氨基酸序列为seqid no:4、seq id no:8或seq id no:12中的任意一种。

9、进一步的，上述抗dll3的纳米抗体cdr1的氨基酸序列如seq id no:1，cdr2的氨基酸序列如seq id no:2，cdr3的氨基酸序列如seq id no:3，vhh的氨基酸序列如seq id no:4；

10、或cdr1的氨基酸序列如seq id no:5，cdr2的氨基酸序列如seq id no:6，cdr3的氨基酸序列如seq id no:7，vhh的氨基酸序列如seq id no:8；

11、或cdr1的氨基酸序列如seq id no:9，cdr2的氨基酸序列如seq id no:10，cdr3的氨基酸序列如seq id no:11，vhh的氨基酸序列如seq id no:12。

12、其中，上述抗体序列如下表1所示：

13、表1抗体氨基酸序列

14、

15、进一步的，上述抗dll3的纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体或融合型纳米抗体中的至少一种。

16、本发明还提供了一种嵌合抗原受体，其胞外域包含了上述抗dll3的纳米抗体。

17、其中，上述嵌合抗原受体中，还包括了信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域。

18、进一步的，所述的信号肽包括cd8α信号肽；铰链区包括cd8α铰链区；跨膜区包括cd28跨膜域；所述信号转导结构域包括cd3ζ或4-1bb胞内区。

19、本发明提供了一种car-t细胞，包括上述嵌合抗原受体。

20、进一步的，所述的述car-t细胞包括通用型car-t细胞和自体car-t细胞中的至少一种。

21、进一步的，本发明还提供了一种分离的多核苷酸，编码上述纳米抗体或嵌合抗原受体。

22、进一步的，上述分离的多核苷酸的核苷酸序列为seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15所示。

23、本发明还提供了一种重组载体，含有上述分离的多核苷酸。

24、本发明还提供了一种宿主细胞，含有上述的重组载体。

25、本发明还提供了一种免疫缀合物或药物组合物，包括上述抗dll3的纳米抗体或嵌合抗原受体。

26、进一步的，本发明还提供了一种上述抗dll3的纳米抗体、嵌合抗原受体、car-t细胞、分离的多核苷酸和宿主细胞在制备预防、诊断或治疗肿瘤的药物中的用途。

27、进一步的，所述的肿瘤包括小细胞肺癌、神经内分泌前列腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃肠胰神经内分泌肿瘤、转移性去势性前列腺癌、大细胞神经内分泌癌、小细胞膀胱癌、肺神经内分泌瘤或多形性胶质细胞瘤中的至少一种。

28、本发明具有以下有益效果：

29、本发明筛选到效果显著的抗dll3纳米抗体，并以抗dll3纳米抗体为抗原结合域制备car-t细胞，得到car-t细胞均具有良好的抗肿瘤活性，可应用于制备预防或治疗小细胞肺癌、神经内分泌前列腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃肠胰神经内分泌肿瘤、转移性去势性前列腺癌、大细胞神经内分泌癌、小细胞膀胱癌、肺神经内分泌瘤或多形性胶质细胞瘤等肿瘤的药物，具有广泛的用途。