靶向PLAA基因的核酸产品、基因编辑系统及其应用的制作方法

本申请涉及生物，特别是涉及一种靶向plaa基因的核酸产品、基因编辑系统及其应用。

背景技术：

1、神经发育障碍疾病可引起全面发育迟缓、智力障碍、癫痫、孤独症谱系等多种致畸致残表型，且起病早，无有效治愈方法，严重影响人口素质，其发病机理和治疗方案的研究是当前神经生物学领域的研究重点。

2、plaa基因突变可导致伴进行性小头畸形、痉挛和脑部异常的神经发育障碍（neurodevelopmental disorder with progressive microcephaly, spasticity, andbrain anomalies，ndmsba），为常染色体隐性遗传。plaa基因相关的神经发育障碍目前已有多个家系报道，患者均在生命早期出现神经发育障碍（出生1天至4个月），表现出生长迟滞、认知与运动功能障碍、进行性小头畸形、四肢痉挛等症状；然而其病理机制至今不明，国际上尚无针对该病的有效治疗方法。

3、人类大脑组织极难获取，尤其是发育阶段的脑组织标本。啮齿类动物模型一直是疾病机制研究和临床前药物评测的关键工具，针对plaa基因缺陷的模型目前仅有突变小鼠被报道。然而，啮齿类动物通过数百万年的进化分离，与人类的神经系统存在显著差异；例如，人的大脑皮层出现了非常大的脑室下区，其中靠近软脑膜的外侧脑室下区存在一类特殊的神经干细胞亚型；又如人的大脑皮层包含外侧放射状胶质细胞，而啮齿类动物脑中没有或仅少量存在。因此，神经系统疾病尚不能在人类和啮齿类动物之间准确转化。

4、目前，已有文献报道在小鼠中观察到与患者表型相似的大脑胼胝体与小脑体积减小、神经功能障碍、后肢瘫痪和神经源性肌无力，但并没有观察到小头畸形这一plaa相关神经发育障碍的典型症状，同时其分子机理并未阐明。而随着对这一基因认识的逐步加深，plaa基因已纳入临床神经发育障碍遗传学筛查的芯片筛查范围，如何判别检出变异的致病性、并针对性地研发治疗性药物是临床研究面临的巨大挑战之一。传统的plaa疾病模型并不能满足这一遗传性神经发育障碍疾病发生机制与治疗方法的研究需求，并且目前并没有能针对plaa基因进行高通量变异致病性、机制分析及药物筛选的细胞模型报道。

技术实现思路

1、基于此，本申请一个或多个实施例提供了一种靶向plaa基因的核酸产品、基因编辑系统及其应用。技术方案包括：

2、根据本申请实施例的第一方面，提供了一种靶向plaa基因的核酸产品，所述核酸产品包括第一grna和第二grna；

3、所述第一grna的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述第二grna的核苷酸序列如seq id no:2所示。

4、根据本申请实施例的第二方面，提供了一种plaa基因的基因编辑系统，所述基因编辑系统包括上述的核酸产品。

5、在其中一个实施例中，所述编辑系统还包括cas9核酸酶和/或cas9 mrna。

6、根据本申请实施例的第三方面，提供了一种plaa基因缺陷的胚胎干细胞系的构建方法，包括如下步骤：

7、采用上述的核酸产品构建plaa基因缺陷的胚胎干细胞系；所述胚胎干细胞系中包括plaa c.62_65del。

8、在其中一个实施例中，包括如下步骤：

9、构建包含上述的核酸产品的表达质粒；和

10、利用所述表达质粒和慢病毒包装质粒感染宿主细胞感染胚胎干细胞，构建所述plaa基因缺失的胚胎干细胞系；

11、其中，所述胚胎干细胞为体外培养且受精14天以内的胚胎分离得到的胚胎干细胞。

12、在其中一个实施例中，所述胚胎干细胞选自chhes-90细胞、hes-h1细胞和hes-h9细胞中的一种或多种。

13、在其中一个实施例中，所述慢病毒包装质粒选自pcmv-vsv-g质粒。

14、在其中一个实施例中，所述构建方法还包括对胚胎干细胞系的基因型进行鉴定的步骤；

15、可选地，所述鉴定的方法包括pcr和sanger测序中的一种或多种。

16、根据本申请实施例的第四方面，提供了一种plaa基因缺陷的胚胎干细胞系，采用上述的构建方法构建得到。

17、根据本申请实施例的第五方面，提供了一种上述的plaa基因缺陷的胚胎干细胞系在筛选治疗或预防神经发育障碍疾病的药物中的应用。

18、与传统技术相比，本申请具有如下有益效果：

19、本申请通过研究筛选得到核苷酸序列如seq id no:1~2所示的靶向plaa基因1号外显子的sgrna组合，基于上述sgrna组合能够高效地敲除plaa基因，从而构建得到模拟神经发育障碍相关疾病的生物模型，为该疾病的分子机制探究和药物筛选提供研究基础。

20、进一步地，本申请的胚胎干细胞系能够为胚胎发育初始阶段的分子水平的发病机制提供线索，同时基于胚胎干细胞向终末组织细胞的诱导分化，能够进一步对神经发育障碍相关疾病的发病进程进行研究。

技术特征：

1.一种靶向plaa基因的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括第一grna和第二grna；

2.一种plaa基因的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括权利要求1所述的核酸产品。

3.根据权利要求2所述的plaa基因的基因编辑系统，其特征在于，所述编辑系统还包括cas9核酸酶和/或cas9 mrna。

4.一种plaa基因缺陷的胚胎干细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的plaa基因缺陷的胚胎干细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的plaa基因缺陷的胚胎干细胞系的构建方法，其特征在于，所述胚胎干细胞选自chhes-90细胞、hes-h1细胞和hes-h9细胞中的一种或多种。

7.根据权利要求5所述的plaa基因缺陷的胚胎干细胞系的构建方法，其特征在于，所述慢病毒包装质粒选自pcmv-vsv-g质粒。

8.根据权利要求5~7任一项所述的plaa基因缺陷的胚胎干细胞系的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括对胚胎干细胞系的基因型进行鉴定的步骤；

9.一种plaa基因缺陷的胚胎干细胞系，其特征在于，采用权利要求4~8任一项所述的构建方法构建得到。

10.如权利要求9所述的plaa基因缺陷的胚胎干细胞系在筛选治疗或预防神经发育障碍疾病的药物中的应用。

技术总结本申请提供了一种靶向PLAA基因的核酸产品、基因编辑系统及其应用。所述核酸产品包括第一gRNA和第二gRNA；所述第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。基于上述sgRNA组合能够高效地敲除PLAA基因，从而构建得到模拟神经发育障碍相关疾病的生物模型，为该疾病的分子机制研究和药物筛选提供基础。技术研发人员：戴聪伶,曾思聪,周旺,周菂,林戈受保护的技术使用者：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10