一种靶向Trop2的NIR-II的荧光探针及其制备方法和应用

本发明涉及生物，针对人滋养细胞表面抗原2(trop2)开发近红外二区(nir-ii)荧光分子探针并引导保乳术切缘评估，具体涉及一种靶向trop2的nir-ii的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、乳腺癌对女性健康构成威胁。长达20年的研究证实，保乳手术(bcs)与乳房切除术在患者长期生存率上并无显著差异，因而bcs已成为早期乳腺癌患者的首选治疗方式。bcs的显著优势在于其能在保留乳房外观的同时，提高患者术后的生活质量。然而，手术中的切缘状态与术后复发风险紧密相连，而当前的辅助放疗和系统治疗在降低切缘阳性患者复发风险方面效果有限。目前，外科医生主要依赖传统的“眼看手触”来评估切缘，但这可能导致高达15％至50％的切缘阳性率，给患者带来严重的身心和经济压力。

2、为了优化手术决策，尽管已有包括冰冻切片和印迹细胞学在内的多种切缘评估方法，但这些方法仍存在操作复杂、耗时较长等局限性。同时，尽管乳腺x线摄影和磁共振成像等技术在诊断上颇具价值，但由于手术室中配置相关设备的限制，其术中应用受到制约。因此，开发一种实时、高效且精确的切缘评估方法显得尤为迫切。

3、荧光分子成像技术，凭借其高灵敏度和实时成像的特点，已成为非侵入性可视化生物进程的新兴技术。与传统成像相比，它在细胞和分子层面提供了更为详尽的微观信息，且具有更高的时空分辨率，同时避免了电离辐射的暴露。特别是fda批准的吲哚菁绿(icg)，已在肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤的手术指导中展现出广泛的应用价值。然而，近红外一区(nir-i)荧光成像技术仍受限于穿透深度和成像对比度。最新研究揭示，第二近红外区(nir-ii，1000-1700nm)的荧光成像技术能显著提升组织穿透深度、对比度和分辨率，为切缘评估带来了新希望。

4、在寻找更为精准的术中导航手段时，我们发现her2受体、vegf-a等肿瘤标志物作为靶点颇具潜力。然而，这些标志物的表达在乳腺癌中并不普遍。值得关注的是，人类滋养层细胞表面抗原2(trop2)在乳腺癌组织中普遍高表达，而在正常组织中低表达或不表达，且fda已批准其作为转移性三阴性和hr+/her2-乳腺癌患者的临床治疗药物。因此，trop2有望成为荧光成像引导乳腺癌术中切缘评估的有效靶点。

技术实现思路

1、本发明的目的在于合成具有优异trop2靶向能力和生物相容性的nir-ii荧光探针，并作为特异性识别乳腺癌的靶向探针，准确区分肿瘤及正常组织、有效判断切缘状态，降低保乳手术切缘阳性率，进而降低患者二次手术率及术后复发风险。

2、为实现上述目的，且考虑到小分子抑制剂和抗体在靶向性和分布特性上的不足，本发明采用了具有适中尺寸和高度亲和力的环肽作为靶向元件，通过nhs酯反应，成功合成了基于trop2靶向环肽和icg-nhs的nir-ii荧光分子探针ttp-icg，用于区分肿瘤与正常组织、指导乳腺癌精确切除，还通过离体标本实验进一步证实了其区分良恶性肿瘤组织的能力，这一突破性的研究为乳腺癌手术中的切缘评估提供了新的、高效的解决方案。

3、具体技术方案如下：

4、一种靶向trop2的nir-ii荧光探针,所述探针为ttp-icg，其通过具有高trop2亲和力的环肽ttp和icg-nhs经nhs酯反应偶联所得。

5、进一步地，ttp-icg靶向在乳腺癌组织中高表达的trop2。

6、一种靶向trop2的nir-ii荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：

7、s1、icg-nhs(10μmol)和ttp(8μmol)溶于2ml二甲基甲酰胺(dmf)中；

8、s2、用n,n-二异丙基乙胺(diea)调节ph至7.5-8.5；

9、s3、室温搅拌2h后，用高效液相色谱法(hplc)纯化目标产物ttp-icg，流动相为溶剂a-水(含0.1％三氟乙酸)及溶剂b-乙腈(含0.1％三氟乙酸)，梯度范围为30-65％，梯度时间15min，流速1.0ml/min，产物收集时间为11min；

10、s4、收集产物冻干后，于-20℃保存。

11、一种靶向trop2的nir-ii荧光探针在外科导航中的应用。

12、进一步地，所述探针ttp-icg能够作为nir-ii荧光成像的荧光指示剂用于区分正常乳腺组织及肿瘤组织。

13、进一步地，所述探针ttp-icg能够作为nir-ii荧光成像的荧光指示剂用于识别微小肿瘤组织。

14、进一步地，所述探针ttp-icg能够作为nir-ii荧光成像的荧光指示剂用于描绘肿瘤轮廓引导肿瘤切除。

15、本发明与背景技术相比，具有如下优点：

16、(1)本发明提供了一种基于fda批准的icg的nir-ii荧光探针ttp，相较于nir-i和可见光区，nir-ii荧光成像具有更低的光散射、光子吸收和组织自荧光，从而极大地提高了荧光穿透深度和对比度，同时icg为fda批准用于人体的荧光染料，较于其它的nir-ii荧光团如稀土纳米探针、量子点等具有更优异的生物相容性，更快的体内代谢，更具有临床转化前景；

17、(2)本发明提供了一种靶向trop2的荧光分子探针，其可通过靶向乳腺癌普遍高表达的trop2，在肿瘤部位特异性主动聚集，较于单纯的荧光染料如icg的被动聚集，具有更优异的肿瘤成像信噪比，较于her2及分泌型蛋白vegf-a等靶点，其具有更广谱的应用前景及靶向稳定性，更有利于术中切缘的评估；

18、(3)选择靶向环肽作为靶向元件，其较于小分子抑制剂具有更高的亲和力，较于抗体具有更低的免疫原性和组织渗透能力，此外环化结构的刚性构象具有更高的受体亲和力和稳定性，因此在具有优异生物相容性的同时，可展现出优异的靶向能力；

19、(4)通过低表达与高表达trop2肿瘤细胞系的混合体系进行探针靶向性评估，其结果更直观、更具可信度；同时，从mmtv-pyvt转基因小鼠模型、多发微小肿瘤模型到肌肉浸润模型，分别评估探针区分正常组织与恶性组织、识别微小卫星灶及评估肿瘤切缘的能力，进而从动物标本到人体标本验证探针临床转化的潜能，利用多尺度、多角度的反复验证模式及从在体到离体，宏观到微观的可行性验证模式，其结果亦更具信服力，更有利于加快推进trop2特异靶向分子探针的临床转化进程；

20、(5)ttp-icg具有可忽略的较低细胞毒性。

技术特征：

1.一种靶向trop2的nir-ii荧光探针，其特征在于,所述探针为ttp-icg，其通过具有高trop2亲和力的环肽ttp和icg-nhs经nhs酯反应偶联所得。

2.根据权利要求1所述的一种靶向trop2的nir-ii荧光探针，其特征在于，ttp-icg靶向在乳腺癌组织中高表达的trop2。

3.一种根据权利要求1所述的一种靶向trop2的nir-ii荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

4.一种根据权利要求1-2任意一项所述的一种靶向trop2的nir-ii荧光探针在外科导航中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述探针ttp-icg能够作为nir-ii荧光成像的荧光指示剂用于区分正常乳腺组织及肿瘤组织。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述探针ttp-icg能够作为nir-ii荧光成像的荧光指示剂用于识别微小肿瘤组织。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述探针ttp-icg能够作为nir-ii荧光成像的荧光指示剂用于描绘肿瘤轮廓引导肿瘤切除。

技术总结本发明公开了一种靶向Trop2的NIR‑II的荧光探针及其制备方法和应用，所述探针为TTP‑ICG，其通过具有高Trop2亲和力的环肽TTP和ICG‑NHS经NHS酯反应偶联所得，该探针生物安全性好，在体成像效果优异，不仅能够在动物模型中在体评估肿瘤切缘状态，还能够通过离体组织浸泡孵育的方法区分肿瘤和正常组织，对引导保乳术手术切缘评估具有显著效果，对减少切缘阳性率及二次手术率进而改善患者预后和生活质量具有重要临床意义。技术研发人员：张国君,楼康良,白静雯,吴川六,林琳玲,刘洪潭,高艺洋受保护的技术使用者：云南省肿瘤医院（昆明医科大学第三附属医院）技术研发日：技术公布日：2024/10/10