一种高效靶向胶质瘤起始细胞的siRNA共递药体系的制备及应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种高效靶向胶质瘤起始细胞的sirna共递药体系的制备及应用。

背景技术：

1、胶质母细胞瘤(gbm)是高恶性、高侵袭性的原发瘤，术中难以实现对肿瘤细胞100％的切除，而残余胶质瘤起始细胞(gic)和胶质瘤细胞是导致肿瘤复发的根本原因，因此，寻找能同时靶向杀伤残余gic和胶质瘤细胞的方法，是抑制脑胶质瘤复发的关键。gbm临床治疗的标准方案是手术切除并辅以术后的放疗和化疗。目前治疗脑胶质瘤还有一些比较成熟的方案包括替莫唑胺(temozolomid，tmz)，丙卡嗪、洛莫司汀和长春新碱(procarbazine lomustine vincristine，pcv)和mtor(mammalian target of rapamycin，mtor)抑制剂。替莫唑胺是治疗胶质瘤的一线化疗药物，它是一种小分子烷基化剂，2005年一项研究表明tmz联合放疗较单纯放疗显著延长了胶质细胞瘤患者的中位生存期，但由于其耐药性的出现，胶质瘤患者的中位生存率仍然很低。pcv是化疗药物的组合，由于其具有缓解临床症状的潜力，在低级别胶质瘤的复发治疗中具有良好的治疗作用。mtor抑制剂是通过直接作用于mtor靶点，抑制活化mtor及其下游蛋白质的活性，干扰肿瘤细胞的生长、分化和代谢。temsirolimus和everolimus是一种小分子抑制剂，可以阻断哺乳动物的mtor，从而调控胶质瘤的生长和进展，但由于其耐药机制的发展，mtor抑制剂的临床试验显示对胶质瘤的疗效非常有限。除上述较成熟的治疗策略以外，还开发了一些有前景的治疗策略包括肿瘤治疗场、免疫疗法、酪氨酸激酶抑制剂等新兴的治疗策略，但都尚未在临床试验中取得较好的治疗效果。米托蒽醌(mit)对gic及脑胶质瘤细胞具有极强的杀伤作用，通过干扰核酸合成和双链断裂修复而导致细胞死亡，且notch 1通路在gic中高度激活并在调控gic的增殖、干性维持等行为中发挥着重要作用。抗癌药物如多柔比星、紫杉醇等存在许多局限性，包括在水溶液中的溶解度差，全身非特异性分布以及癌细胞耐药性等，因此，基于单一药物的癌症治疗策略是不完善的。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种高效靶向胶质瘤起始细胞的sirna共递药体系的制备及应用。

2、本发明采用的技术方案是：一种负载米托蒽醌和sirna的外泌体递药体系，dvap靶向肽修饰的外泌体，其内包载sirna和米托蒽醌(mitoxantrone,mit)。

3、优选地，sirna序列如seq id no.1和seq id no.2所示。

4、负载米托蒽醌和sirna的外泌体递药体系的构建方法，包括如下步骤：

5、步骤一：dvap靶向肽修饰外泌体得到dvap-exo；

6、步骤二：将sirna和mit包载到dvap-exo中，得到dvap-exo/mit/sirna。

7、优选地，步骤一中，先将dbco连接在外泌体外表面，得到dbco-exo，再将dvap-n3与dbco-exo混合孵育后，得到dvap靶向肽修饰的外泌体dvap-exo。

8、优选地，将10μm的dbco-sulfo-nhs溶解于dmso，加入重悬于pbs中的外泌体，在25℃、120rpm的条件下反应4h，除去多余的dbco-sulfo-nhs得到dbco-exo；

9、将叠氮基团修饰的dvap-n3与dbco-exo在4℃、摇床100rpm的条件下孵育，消除游离的肽，制备得到dvap-exo。

10、优选地，步骤二中，采用共孵育和转染试剂合并法，将sirna和mit包载到修饰后的外泌体中。

11、优选地，具体包括：

12、步骤1：按照dvap-exo：mit：sirna＝10：8：1的比例将mit、dvap-exo和sirna混匀，加入exo-fect转染试剂在37℃孵育20min，之后加入exoquick-tc试剂，冰上静置30min；

13、步骤2：在4℃、13000rpm的条件下离心3min，弃去上清保留沉淀，加适量pbs重悬，将得到的体系在透析袋中透析10h，得到dvap-exo/mit/sirna。

14、负载米托蒽醌和sirna的外泌体递药体系在制备抗胶质瘤药物中的应用。

15、优选地，负载米托蒽醌和sirna的外泌体递药体系能够作用于残余胶质瘤起始细胞和或胶质瘤细胞。

16、本发明具有的优点和积极效果是：利用靶向修饰的外泌体共载米托蒽醌和sirna，米托蒽醌为可触发免疫原性细胞死亡的化疗药，形成的递药体系对胶质瘤起始细胞有强杀伤作用，sirna为可降低胶质瘤起始细胞干性的小干扰核酸(sinotch 1)，实现对残余的胶质瘤起始细胞和肿瘤细胞的靶向追踪与杀伤，为胶质母细胞瘤治疗提供了一种新策略。

技术特征：

1.一种高效靶向胶质瘤起始细胞的sirna共递药体系，其特征在于：dvap靶向肽修饰的外泌体，其内包载sirna和米托蒽醌。

2.根据权利要求1所述的高效靶向胶质瘤起始细胞的sirna共递药体系，其特征在于：sirna序列如seq id no.1和seq id no.2所示，dvap靶向肽序列如seq id no.3所示。

3.权利要求1或2所述的高效靶向胶质瘤起始细胞的sirna共递药体系的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的高效靶向胶质瘤起始细胞的sirna共递药体系的构建方法，其特征在于：步骤一中，先将dbco连接在外泌体外表面，得到dbco-exo，再将dvap-n3与dbco-exo混合孵育后，得到dvap靶向肽修饰的外泌体dvap-exo。

5.根据权利要求4所述的高效靶向胶质瘤起始细胞的sirna共递药体系的构建方法，其特征在于：将10μm的dbco-sulfo-nhs溶解于dmso，加入重悬于pbs中的外泌体，在25℃、120rpm的条件下反应4h，除去多余的dbco-sulfo-nhs得到dbco-exo；

6.根据权利要求3所述的高效靶向胶质瘤起始细胞的sirna共递药体系的构建方法，其特征在于：步骤二中，采用共孵育和转染试剂合并法，将sirna和mit包载到dvap-exo中。

7.根据权利要求6所述的高效靶向胶质瘤起始细胞的sirna共递药体系的构建方法，其特征在于：具体包括：

8.权利要求1或2所述的高效靶向胶质瘤起始细胞的sirna共递药体系在制备抗胶质瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：负载米托蒽醌和sirna的外泌体递药体系能够作用于胶质瘤起始细胞和或胶质瘤细胞。

技术总结本发明涉及一种高效靶向胶质瘤起始细胞的siRNA共递药体系的制备及应用，采用点击化学的方法对外泌体进行了<supgt;D</supgt;VAP靶向肽的修饰，再将siRNA和米托蒽醌包载到外泌体中，构建得到靶向修饰的载药外泌体<supgt;D</supgt;VAP‑Exo/siRNA/MIT。靶向修饰的外泌体共载对胶质瘤起始细胞有强杀伤作用，并可触发免疫原性细胞死亡的化疗药米托蒽醌和可降低胶质瘤起始细胞干性的小干扰核酸(siNotch 1)，实现对残余的胶质瘤起始细胞和肿瘤细胞的靶向追踪与杀伤，为胶质母细胞瘤治疗提供了一种新策略。技术研发人员：贺慧宁,杨孟亭,朱梦玺,于飞,孙璐,王建新受保护的技术使用者：天津键凯科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10