BnSNAT4蛋白及其编码基因在催化5-羟色胺合成N-乙酰基-5-羟色胺中的应用

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及bnsnat4蛋白及其编码基因在催化5-羟色胺合成n-乙酰基-5-羟色胺中的应用。

背景技术：

1、褪黑素(melatonin，mt)是一种新兴的植物激素。从化学结构上讲，mt是一种色氨酸衍生物，化学名称为n-乙酰-5-甲氧基色胺，是广泛存在于动植物体内的小分子吲哚胺类物质。从生理功能上来说，mt与其他植物激素相似，它不仅调控种子萌发和根系构型，也调节昼夜节律、光周期及生物和非生物胁迫耐性。mt不仅可以调节种子萌发、根系构型、气孔运动、生物节律和开花与衰老，还通过激活抗氧化系统的活力，清除活性氧(reactiveoxygen species,ros)，从而减轻胁迫造成的氧化胁迫、渗透胁迫、蛋白变性和细胞损伤，最终使植物应答生物和非生物胁迫。随着研究的深入，发现mt在正常生理条件下，其在植物体内的含量很低，但在高温、低温、干旱、盐渍、重金属、紫外辐射和水涝等逆境胁迫下，mt的含量可增加上百倍，继而引发mt信号，增强植物对这些逆境胁迫的抵抗能力。

2、褪黑素在植物体内的合成起始于色氨酸，以5-羟色胺为中间体，最终合成褪黑素。在合成过程中，色氨酸在色氨酸脱羧酶(tdc)的催化作用下形成色胺，接着在色胺-5-羟化酶(t5h)催化下将色胺转化成5-羟色胺，5-羟色胺通过5-羟色胺-n-乙酰基转移酶(snat)被乙酰化成n-乙酰基-5-羟色胺，随即被n-乙酰基-5-羟色胺甲基转移酶(asmt)和咖啡酸-0-甲基转移酶(comt)催化合成褪黑素。此外，5-羟色胺也可以先被asmt/comt催化为5-甲氧基色胺，之后再在snat的作用下合成褪黑素。

3、目前，在褪黑素对油菜的影响的研究中，均为使用外源褪黑素，对于油菜内源褪黑素的合成以及关键酶的研究存在空白。

技术实现思路

1、针对现有技术中对于油菜合成褪黑素关键酶的研究空白，本发明提供了bnsnat4蛋白及其编码基因在催化5-羟色胺合成n-乙酰基-5-羟色胺中的应用，具体技术方案如下：

2、第一方面，本发明提供了bnsnat4蛋白在催化5-羟色胺合成n-乙酰基-5-羟色胺中的应用，所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、第二方面，本发明提供了bnsnat4基因在催化5-羟色胺合成n-乙酰基-5-羟色胺中的应用，所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明中通过对snat家族基因的鉴定，并进行蛋白中是否存在gnat结构域和叶绿体转运肽这两种结构的筛选，最终筛选得到bnpir中基因号为bnac04t0550700we的基因，确认其表达产物具有将5-羟色胺催化为n-乙酰基-5-羟色胺的功能，将该表达产物命名为bnsnat4蛋白。

5、第三方面，本发明提供了一种重组载体在催化5-羟色胺合成n-乙酰基-5-羟色胺中的应用，所述重组载体包含有bnsnat4基因；所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq idno.2所示。

6、第四方面，本发明提供了一种基因工程菌在催化5-羟色胺合成n-乙酰基-5-羟色胺中的应用，所述基因工程菌包含bnsnat4基因；所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq idno.2所示。

7、第五方面，本发明提供了一种n-乙酰基-5-羟色胺的生产方法，包括：在乙酰基供体存在的情况下，以5-羟色胺为底物，利用催化剂催化合成n-乙酰基-5-羟色胺；

8、所述催化剂为bnsnat4蛋白或其固定化酶，或者含bnsnat4基因的基因工程菌，或者所述基因工程菌发酵后的粗酶液或湿菌体；

9、所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

10、进一步地，所述乙酰基供体为乙酰辅酶a。

11、进一步地，所述乙酰辅酶a与5-羟色胺的摩尔比为1：1。

12、第六方面，本发明提供了bnsnat4蛋白在促进油菜植株n-乙酰基-5-羟色胺合成中的应用，所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

13、第七方面，bnsnat4蛋白在促进油菜植株褪黑素合成中的应用，所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

14、目前，在油菜体内还未鉴定到snat基因，而本发明筛选得到的bnsnat4基因其表达产物具有将5-羟色胺催化生成n-乙酰基-5-羟色胺的作用，可以参与油菜体内n-乙酰基-5-羟色胺合成的进程，以帮助油菜合成褪黑素。

15、进一步地，在油菜植株褪黑素合成中，5-羟色胺在bnsnat4蛋白的催化作用下生成n-乙酰基-5-羟色胺。

16、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

17、本发明在油菜中鉴定得到一种新的5-羟色胺-n-乙酰基转移酶bnsnat4蛋白，其由bnpir库中基因号为bnac04t0550700we的基因编码，经过验证bnsnat4蛋白可以将5-羟色胺催化为n-乙酰基-5-羟色胺。油菜中bnsnat4蛋白的发现填补了油菜合成褪黑素关键酶的研究空白，并且对于褪黑素的内源合成研究以及snat家族种类的进一步研究具有重要意义。

技术特征：

1.bnsnat4蛋白在催化5-羟色胺合成n-乙酰基-5-羟色胺中的应用，其特征在于，所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.bnsnat4基因在催化5-羟色胺合成n-乙酰基-5-羟色胺中的应用，其特征在于，所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.一种重组载体在催化5-羟色胺合成n-乙酰基-5-羟色胺中的应用，其特征在于，所述重组载体包含有bnsnat4基因；所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4.一种基因工程菌在催化5-羟色胺合成n-乙酰基-5-羟色胺中的应用，其特征在于，所述基因工程菌包含bnsnat4基因；所述bnsnat4基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

5.一种n-乙酰基-5-羟色胺的生产方法，其特征在于，在乙酰基供体存在的情况下，以5-羟色胺为底物，利用催化剂催化合成n-乙酰基-5-羟色胺；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述乙酰基供体为乙酰辅酶a。

7.bnsnat4蛋白在促进油菜植株n-乙酰基-5-羟色胺合成中的应用，其特征在于，所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

8.bnsnat4蛋白在促进油菜植株褪黑素合成中的应用，其特征在于，所述bnsnat4蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，油菜植株褪黑素合成中，5-羟色胺在bnsnat4蛋白的催化作用下生成n-乙酰基-5-羟色胺。

技术总结本发明属于植物基因工程领域，具体涉及BnSNAT4蛋白及其编码基因在催化5‑羟色胺合成N‑乙酰基‑5‑羟色胺中的应用，所述BnSNAT4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明在油菜中鉴定得到一种新的5‑羟色胺‑N‑乙酰基转移酶BnSNAT4蛋白，其由BnPIR库中基因号为BnaC04T0550700WE的基因编码。经过验证，BnSNAT4蛋白可以将油菜体内的5‑羟色胺催化为N‑乙酰基‑5‑羟色胺。油菜中BnSNAT4蛋白的发现填补了油菜合成褪黑素关键酶的研究空白，并且对于褪黑素的内源合成研究以及SNAT家族种类的进一步研究具有重要意义。技术研发人员：郭小浩,董杰,盖小斌,谭瑗瑗,舒庆尧受保护的技术使用者：浙江大学技术研发日：技术公布日：2024/10/10